熒光假單胞菌是革蘭氏陰性菌,是養(yǎng)殖魚類常見病原之一。在前期研究中,我們自病魚組織中分離到一株魚類致病性熒光假單胞菌TSS,并發(fā)現(xiàn)鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur（ferric uptake regulator）對該菌株的致病性至關(guān)重要。Fur是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過識別和結(jié)合特定的DNA序列控制靶向基因的表達。本研究通過比較蛋白質(zhì)組學手段系統(tǒng)分析了TSS野生株和fur敲除株的全蛋白表達譜差異,共鑒定出分屬于不同功能類群的28個差異表達蛋白;針對其中四個蛋白,即TssP（VI型分泌系統(tǒng)蛋白）、PspA（絲氨酸蛋白酶）、OprF（外膜蛋白）和ClpP（ATP依賴的Clp蛋白酶水解亞基）,分別進行了基因敲除并獲得了相應(yīng)突變株;以大菱鲆為實驗動物,對這四株突變菌株進行功能檢測,發(fā)現(xiàn)oprF和clpP敲除株在抗宿主血清殺傷、侵染宿主組織和導(dǎo)致宿主死亡等三方面的能力均顯著下降,相比之下,tssP和pspA突變株與野生株的致病性沒有明顯差異;大腸桿菌異源表達的重組OprF蛋白經(jīng)純化后作為亞單位疫苗免疫大菱鲆,可在受免魚中引起特異性血清抗體的產(chǎn)生,并對TSS感染具有顯著的免疫保護作用;另外發(fā)現(xiàn),OprF抗體封閉致... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)山東省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

Fur調(diào)控的細胞過程的概況

道發(fā)現(xiàn)來自不同生物體的 Fur 都可以與血紅素發(fā)生結(jié)合。在大腸桿菌，一個血紅素分子與 Fur 二聚體的緊密相互作用（Kd<1 μM）阻止了鋅和錳與該金屬調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，表明了 Fur-血紅素復(fù)合物在細菌代謝調(diào)節(jié)中具有潛在作用（Smith et al.,1996）。魚腥藻 PCC 7120 的 FurA 可以等摩爾比特異性地結(jié)合血紅素，這種不同類型的交互作用使 FurA 失去了對 DNA 的親和力（Hernandez et al., 2004b）。與大腸桿菌蛋白不同，F(xiàn)urA 具有可以與血紅素結(jié)合的半胱氨酸-脯氨酸調(diào)節(jié)基序。光譜學和突變分析證實了半胱氨酸是 Fe2+-血紅素的一個軸向配位體，也證明了FurA 具有一個氧化還原依賴性的配體開關(guān)（Palleroni and Bradbury, 1993（）圖 1.3）。因為 Fe2+-血紅素相互作用滿足基于血紅素感應(yīng)蛋白的所有特征，所以研究人員提出，血紅素可能作為不同的環(huán)境中的藍藻細菌的光合營養(yǎng)細胞和微需氧異形細胞的氧化還原信號。關(guān)于血紅素是否也可以在其它厭氧呼吸的細菌中通過 Fur 間接調(diào)控氧氣感應(yīng)（Teixido et al., 2010; Yang et al., 2013）需要進一步的研究。

熒光假單胞菌 Fur 調(diào)控蛋白及其功能研究1 敲除株 TSS oprF 的構(gòu)建prF 基因缺失片段的獲得利用自殺性質(zhì)粒 p7TS（Wang et al., 2009）構(gòu)建基因缺失突變rlap PCR 法完成缺失片段的克隆。第一步 PCR 分別擴增出待缺失游序列，并且兩個目的片段末端有小部分堿基重疊；第二步以第片段混合物為模板進行 PCR，通過其堿基重疊區(qū)域退火，擴增缺失片段。技術(shù)路線如圖 3.1 所示：因敲除

【參考文獻】：
期刊論文
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