以Tris平衡酚-氯仿法提取的龍頭魚基因組DNA為ISSR-PCR擴(kuò)增模板,采用單因素試驗法,對影響PCR擴(kuò)增體系的d NTPs、模板DNA、引物濃度和Taq DNA聚合酶4種試劑的用量作為獨立因素進(jìn)行優(yōu)化,創(chuàng)建了最適合龍頭魚的ISSRPCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明:20μL的PCR反應(yīng)液的組分和用量為含Mg2+的10×PCR Buffer 2.0μL,d NTPs2.5μL,Taq DNA聚合酶0.2μL,引物1.0μL,DNA模板1.4μL,雙蒸水12.9μL時擴(kuò)增條帶最清晰。這一實驗結(jié)果為龍頭魚后續(xù)開展ISSR遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：科技風(fēng). 2020,(32)

【文章頁數(shù)】：3 頁

【部分圖文】：

DNA模板濃度對ISSR-PCR的影響

d NTPs是進(jìn)行PCR反應(yīng)的重要原材料之一，d NTPs的濃度變化對PCR的擴(kuò)增有著密不可分的關(guān)系。d NTPs濃度過高，會導(dǎo)致聚合酶錯誤摻入，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，過低則會造成擴(kuò)增產(chǎn)物量少[19]。本實驗設(shè)置的8個d NTPs濃度均能擴(kuò)增出條帶(圖2)，條帶的清晰程度肉眼難以區(qū)別。在降低經(jīng)濟(jì)成本與保證清晰度的前提下，建議將d NTPs濃度調(diào)整為2.5μL，此時擴(kuò)增條帶最清晰且拖帶較少。2.3 Taq聚合酶濃度對ISSR-PCR的影響

Taq聚合酶濃度過高會引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則PCR產(chǎn)物量減少[20]。本實驗比較了0.5μL、0.4μL、0.3μL、0.2μL、0.1μL五個梯度的Taq DNA聚合酶濃度對ISSR-PCR效率的影響，結(jié)果表明五種濃度Taq DNA聚合酶均可擴(kuò)增出條帶，相較而言0.2μL和0.4μL時擴(kuò)增條帶更清晰(圖3)，從經(jīng)濟(jì)成本角度選擇0.2μL Taq DNA聚合酶作為龍頭魚ISSR-PCR實驗最優(yōu)選擇。2.4 引物濃度對ISSR-PCR的影響

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3287857