海參是一種對(duì)外界環(huán)境極其敏感的動(dòng)物,環(huán)境理化因素的變化都能誘發(fā)其自溶,造成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解�；|(zhì)金屬蛋白酶是一大類細(xì)胞外蛋白水解酶,幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。MMPs的活性受基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的嚴(yán)格調(diào)控。前期研究表明,MMP是參與海參自溶的一類重要蛋白酶。而海參自溶過程中,MMP及TIMP在基因水平的表達(dá)情況尚無報(bào)道。因此,本文克隆了海參MMP-1和TIMP-1基因,對(duì)其組織分布及自溶過程中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。以期從MMP-1/TIMP-1基因表達(dá)調(diào)控的角度,揭示海參自溶機(jī)制。提取海參腸RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用PCR擴(kuò)增及RACE,得到MMP-1及TIMP-1基因序列。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)其在海參六種組織及自溶過程中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,MMP-1全長cDNA為1691bp,編碼507個(gè)氨基酸；TIMP-1全長cDNA包含721bp,編碼192個(gè)氨基酸。在體壁背部、體壁腹部、腸道、呼吸樹、體腔液細(xì)胞和縱行肌中,MMP-1在呼吸樹中的相對(duì)表達(dá)量最高,TIMP-1在體腔細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量最高；海參自溶過程中兩個(gè)基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢(shì),自溶6h,管足和... 

【文章來源】：大連工業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 海參簡(jiǎn)介
    1.2 海參自溶與蛋白酶
    1.3 基質(zhì)金屬蛋白酶簡(jiǎn)介
        1.3.1 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)
        1.3.2 MMPs的結(jié)構(gòu)
        1.3.3 MMPs的分類和特點(diǎn)
        1.3.4 MMPs的研究進(jìn)展
    1.4 內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑簡(jiǎn)介
        1.4.1 內(nèi)源性蛋白酶抑制劑
        1.4.2 TIMPs的分類及功能
        1.4.3 TIMPs的研究進(jìn)展
    1.5 MMP及TIMP相互作用
    1.6 立題背景和意義
第二章 海參MMP和TIMP全長序列的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)原料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.2.3.1 海參Total RNA的提取與純化
            2.2.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.3.3 cDNA的合成
        2.2.4 目的基因cDNA全長序列的獲取
            2.2.4.1 特異性片段的獲取
            2.2.4.2 3'RACE擴(kuò)增
        2.2.5 目的基因ORF驗(yàn)證及測(cè)序
            2.2.5.1 PCR擴(kuò)增
            2.2.5.2 PCR產(chǎn)物的純化
            2.2.5.3 PCR產(chǎn)物的克隆及驗(yàn)證
            2.2.5.4 質(zhì)粒提取及測(cè)序
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 總RNA提取檢驗(yàn)
        2.3.2 海參MMP序列及生物信息學(xué)分析
            2.3.2.1 海參MMP序列的獲取
            2.3.2.2 cDNA全長序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果
        2.3.3 海參TIMP序列及生物信息學(xué)分析結(jié)果
            2.3.3.1 海參TIMP序列的獲取
            2.3.3.2 cDNA全長序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果
    2.4 小結(jié)
第三章 海參自溶過程中MMP-1及TIMP-1的基因表達(dá)
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原料及處理
            3.2.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
            3.2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.2.0 海參Total RNA的提取與純化
            3.2.2.1 RNA純化及反轉(zhuǎn)
            3.2.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
            3.2.2.3 熒光Real-Time PCR
            3.2.2.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.2.2.5 樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 RNA提取結(jié)果
        3.3.2 Real-Time PCR檢測(cè)方法的建立
            3.3.2.1 Cyt-b基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            3.3.2.2 MMP-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            3.3.2.3 TIMP-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.3.3 Real-Time PCR定量結(jié)果
            3.3.3.1 MMP-1和TIMP-1的組織分布
            3.3.3.3 時(shí)序表達(dá)結(jié)果
    3.4 小結(jié)
第四章 海參TIMP-1的蛋白重組表達(dá)
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
            4.2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
            4.2.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化
            4.2.2.3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序
            4.2.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
            4.2.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及鑒定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序
        4.3.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]白鰱骨骼肌絲氨酸蛋白酶抑制劑的提取、純化及其特性[J]. 胡新穎,劉歡,張楠,馬長偉.  中國水產(chǎn)科學(xué). 2006(02)
[2]基質(zhì)金屬蛋白酶研究進(jìn)展[J]. 劉豐彬,段立公.  山西體育科技. 2005(03)
[3]基質(zhì)金屬蛋白酶和消化道腫瘤的相關(guān)性[J]. 范玉晶,韓明子.  世界華人消化雜志. 2004(09)
[4]植物種子的蛋白酶抑制劑及其生理功能[J]. 文方德,傅家瑞.  植物生理學(xué)通訊. 1997(01)
[5]細(xì)胞外基質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 金博,李玉彬.  醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐. 1996(03)
[6]魚類自溶作用[J]. 戴志遠(yuǎn).  浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào). 1990(01)



本文編號(hào)：3246301