有頜類脊椎動(dòng)物中出現(xiàn)的基于淋巴細(xì)胞的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)里程碑,它能夠針對(duì)特異的抗原,辨別自我和非我,并且能夠形成免疫記憶。B細(xì)胞以及其表達(dá)的免疫球蛋白是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,而在免疫球蛋白基因表達(dá)過程中,激活誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）是一個(gè)非常重要的蛋白因子。AID能夠?qū)е翫NA中的胞嘧啶脫去氨基,轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在后續(xù)的修復(fù)過程中,AID能夠引發(fā)體細(xì)胞超突變（SHM）、基因轉(zhuǎn)換（GC）和類別轉(zhuǎn)換重組（CSR）等過程,這些過程能夠改變B細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū),極大地豐富了免疫球蛋白可變區(qū)的多樣性和恒定區(qū)的效應(yīng)作用。在脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化過程中,參與免疫球蛋白基因表達(dá)的上述特殊機(jī)制如體細(xì)胞超突變和類別轉(zhuǎn)換重組并不是同時(shí)出現(xiàn)的。在低等的脊椎動(dòng)物魚類中,免疫球蛋白基因體細(xì)胞超突變發(fā)生頻率非常低,而類別轉(zhuǎn)換重組過程則沒有被發(fā)現(xiàn)。為了研究脊椎動(dòng)物早期進(jìn)化過程中這些機(jī)制的作用,在本論文的研究中我們構(gòu)建了Aicda基因敲除的斑馬魚。我們以Tubingen斑馬魚品系為材料,利用TALEN... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
英文縮略詞表
第一章 綜述
    1.1 免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)
        1.1.1 免疫球蛋白種類
        1.1.2 免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)
        1.1.3 免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)
    1.2 免疫球蛋白多樣性的產(chǎn)生機(jī)制
        1.2.1 免疫球蛋白可變區(qū)多樣性產(chǎn)生機(jī)制
        1.2.2 免疫球蛋白的恒定區(qū)的轉(zhuǎn)換
        1.2.3 激活誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶
    1.3 免疫球蛋白基因及其表達(dá)機(jī)制的進(jìn)化
        1.3.1 免疫球蛋白重鏈基因的進(jìn)化
        1.3.2 免疫球蛋白表達(dá)機(jī)制的進(jìn)化
    1.4 硬骨魚類的免疫系統(tǒng)
        1.4.1 硬骨魚類免疫球蛋白的種類
        1.4.2 硬骨魚類免疫球蛋白重鏈基因結(jié)構(gòu)
        1.4.3 硬骨魚類免疫球蛋白的表達(dá)機(jī)制
    1.5 斑馬魚模型
        1.5.1 斑馬魚
        1.5.2 斑馬魚在免疫系統(tǒng)研究中的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本
        2.1.2 質(zhì)粒和菌株
        2.1.3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒
        2.1.4 主要試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 TALEN構(gòu)建
        2.3.2 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        2.3.3 斑馬魚卵的收集
        2.3.4 顯微注射
        2.3.5 DNA提取
        2.3.6 RNA提取
        2.3.7 反轉(zhuǎn)錄方法
        2.3.8 常用PCR體系和條件
        2.3.9 T-A克隆
        2.3.10 定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.11 斑馬魚血液涂片制作及白細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.3.12 斑馬魚的免疫
        2.3.13 斑馬魚血清制備
        2.3.14 斑馬魚血清總蛋白含量測(cè)定
        2.3.15 ELISA法檢測(cè)斑馬魚卵中特異抗體滴度
        2.3.16 嗜水氣單胞桿菌培養(yǎng)和收集
        2.3.17 嗜水氣單胞桿菌OD-CFU曲線測(cè)定
        2.3.18 嗜水氣單胞桿菌浸染斑馬魚
        2.3.19 5’RACE實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.20 鰻弧菌的培養(yǎng)和收集
        2.3.21 鰻弧菌免疫和攻毒
    2.4 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 突變斑馬魚的Aicda基因
        3.1.1 驗(yàn)證斑馬魚Aicda基因組序列信息
        3.1.2 利用鋅指酶技術(shù)突變斑馬魚的Aicda基因
        3.1.3 利用TALEN技術(shù)突變斑馬魚的Aicda基因
    3.2 Aicda基因突變斑馬魚品系的建立
        3.2.1 篩選Aicda基因突變的嵌合體F_0代斑馬魚
        3.2.2 篩選Aicda基因突變的雜合體F_1代斑馬魚
        3.2.3 篩選和鑒定Aicda基因突變的純合體F_2代斑馬魚
    3.3 斑馬魚主要免疫球蛋白的表達(dá)
        3.3.1 μ基因在斑馬魚的不同器官中的表達(dá)
        3.3.2 ζ基因在斑馬魚的不同器官中的表達(dá)分析
        3.3.3 斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期Aicda基因的表達(dá)
        3.3.4 斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期μ基因的表達(dá)
        3.3.5 斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期ζ基因的表達(dá)
    3.4 基因組水平檢測(cè)J_H下游內(nèi)含子區(qū)域的體細(xì)胞超突變的發(fā)生
        3.4.1 高保真酶的選擇
        3.4.2 J_H內(nèi)含子擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)
        3.4.3 體細(xì)胞超突變分析
        3.4.4 J_H內(nèi)含子上游CDR3區(qū)域的N-P核苷酸分析
    3.5 TNP-BSA免疫后斑馬魚的免疫球蛋白可變區(qū)分析
        3.5.1 TNP-BSA免疫斑馬魚
        3.5.2 構(gòu)建斑馬魚IgM的可變區(qū)cDNA文庫
        3.5.3 CDR3統(tǒng)計(jì)分析
        3.5.4 V_H基因家族使用情況分析
        3.5.5 JH基因片段使用情況分析
    3.6 ELISA檢測(cè)TNP-BSA免疫后血清中特異抗體滴度
        3.6.1 TNP-BSA免疫斑馬魚、獲取斑馬魚血清以及血清總蛋白濃度測(cè)定
        3.6.2 ELISA檢測(cè)斑馬魚中特異抗體的含量
    3.7 ELISA檢測(cè)斑馬魚血清中的IgM和IgZ含量
        3.7.1 斑馬魚血清的獲取和濃度測(cè)定
        3.7.2 ELISA檢測(cè)斑馬魚血清中IgM和IgZ的含量
    3.8 斑馬魚主要組織器官觀察
    3.9 嗜水氣單胞桿菌浸染斑馬魚
        3.9.1 嗜水氣單胞桿菌OD-CFU曲線
        3.9.2 嗜水氣單胞桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)
        3.9.3 死亡斑馬魚體征
        3.9.4 死亡斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)檢測(cè)
        3.9.5 死亡斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)嗜水氣單胞桿菌的分離
        3.9.6 存活斑馬魚基因組中嗜水氣單胞桿菌含量
    3.10 鰻弧菌侵染斑馬魚
        3.10.1 制弱鰻弧菌疫苗免疫斑馬魚
        3.10.2 致病株鰻弧菌侵染未免疫的斑馬魚
        3.10.3 致病株鰻弧菌侵染免疫后的斑馬魚
        3.10.4 ELISA檢測(cè)免疫后斑馬魚血清中鰻弧菌特異抗體的滴度
    3.11 斑馬魚IgM和IgZ類別轉(zhuǎn)換重組研究
        3.11.1 設(shè)計(jì)類別轉(zhuǎn)換重組檢測(cè)引物
        3.11.2 巢式PCR擴(kuò)增J_ζ-C_μ1拼接產(chǎn)物
    3.12 討論與展望
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高絲氨酸內(nèi)酯酶AI-96對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-1浸浴攻毒斑馬魚保護(hù)效應(yīng)的研究[J]. 何夙旭,張美超,徐俐,楊雅麟,李青,周志剛.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2013(01)



本文編號(hào)：3233913