哺乳動物中,CD6分子作為來自清道夫受體家族的一種淋巴細(xì)胞特異性表面受體,在抗炎癥反應(yīng)以及T細(xì)胞激活中具有重要作用,兼顧先天性免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)控。但是,CD6分子在以硬骨魚類為代表的低等脊椎動物中的特性和功能尚不清楚。為探究魚類CD6分子功能,本論文以尼羅羅非魚為對象克隆鑒定了CD6分子（On CD6）及其配體CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展開了以下4個方面的工作:（1）通過原核表達(dá)獲取了On CD6胞外段蛋白,制備單克隆抗體,探究了On CD6分子富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域胞外段蛋白的生物學(xué)功能;（2）以羅非魚頭腎淋巴細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)探究了On CD6分子參與炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制;（3）通過GST Pull-Down確定了On CD6分子與其配體的互作及互作結(jié)構(gòu)域（4）初步探究了On CD6分子及其配體參與的信號通路。取得的研究結(jié)果如下:1、On CD6分子作為清道夫受體具備模式識別受體的功能本研究成功克隆鑒定了羅非魚CD6基因,該分子定位于淋巴細(xì)胞膜上。體外實(shí)驗(yàn)表明On CD6分子胞外段重組蛋白On CD6-ECD在Ca²⁺作用下能夠廣泛識... 

【文章來源】：廣東海洋大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 免疫應(yīng)答機(jī)制概述
        1.1.1 先天性免疫
        1.1.2 適應(yīng)性免疫
        1.1.3 T細(xì)胞激活機(jī)制
    1.2 清道夫受體概述
        1.2.1 清道夫受體家族分類
        1.2.2 清道夫受體家族功能
    1.3 CD6的研究進(jìn)展
        1.3.1 CD6分子結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 CD6分子生理功能
        1.3.3 CD6分子配體概述
    1.4 研究目的和意義
2 OnCD6分子的克隆和表達(dá)特征分析
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)用魚
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)引物
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)用魚及預(yù)處理
        2.3.2 總RNA提取和c DNA合成
        2.3.3 OnCD6基因克隆
        2.3.4 OnCD6生物信息學(xué)分析
        2.3.5 OnCD6實(shí)時熒光定量
        2.3.6 OnCD6胞外段原核表達(dá)
        2.3.7 OnCD6單克隆抗體制備方法
        2.3.8 OnCD6亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息學(xué)分析
        2.4.2 OnCD6的組織分布
        2.4.3 OnCD6在無乳鏈球菌刺激后的表達(dá)模式
        2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表達(dá)模式
        2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表達(dá)模式
        2.4.6 OnCD6胞外段的原核表達(dá)及純化
        2.4.7 OnCD6的單克隆抗體制備
        2.4.8 OnCD6的亞細(xì)胞定位
    2.5 實(shí)驗(yàn)討論
3 OnCD6體外功能驗(yàn)證
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)引物
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 OnCD6-ECD與細(xì)菌結(jié)合檢測
        3.3.2 OnCD6-ECD與 PAMPs結(jié)合檢測
        3.3.3 OnCD6-ECD誘導(dǎo)細(xì)菌凝集檢測
        3.3.4 OnCD6-ECD體外抑菌實(shí)驗(yàn)
        3.3.5 OnCD6-ECD參與吞噬反應(yīng)檢測
        3.3.6 OnCD6-ECD對 HKLs呼吸爆發(fā)影響的實(shí)驗(yàn)
        3.3.7 OnCD6-ECD對 HKLs炎癥因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)
        3.3.8 OnCD6-ECD及其單克隆抗體對HKLs增殖影響的實(shí)驗(yàn)
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 OnCD6-ECD參與結(jié)合細(xì)菌
        3.4.2 OnCD6-ECD與 PAMPs結(jié)合
        3.4.3 OnCD6-ECD誘導(dǎo)細(xì)菌凝集反應(yīng)
        3.4.4 OnCD6-ECD具有體外抑菌活性
        3.4.5 OnCD6-ECD促進(jìn)HKLs對細(xì)菌吞噬
        3.4.6 OnCD6-ECD對 HKLs呼吸爆發(fā)的影響
        3.4.7 OnCD6-ECD對 HKLs炎癥因子表達(dá)的影響
        3.4.8 OnCD6-ECD及其單克隆抗體對HKLs增殖的影響
    3.5 實(shí)驗(yàn)討論
4 OnCD6體內(nèi)功能探究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)用魚
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)病菌
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        4.2.5 實(shí)驗(yàn)引物
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚存活率影響實(shí)驗(yàn)
        4.3.2 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚載菌量的檢測
        4.3.3 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚病理生化指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)
        4.3.4 CD6體內(nèi)過表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)探究實(shí)驗(yàn)
        4.3.5 HE染色
        4.3.6 生化指標(biāo)檢測
        4.3.7 通路抑制劑孵育HKLs檢測信號通路
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚生存率的影響
        4.4.2 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚載菌量影響
        4.4.3 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚病理變化的影響
        4.4.4 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚外周血生化指標(biāo)的影響
        4.4.5 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚炎癥因子表達(dá)的影響
        4.4.6 OnCD6體內(nèi)過表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果
        4.4.7 OnCD6體內(nèi)過表達(dá)對無乳鏈球菌感染羅非魚存活率的影響
        4.4.8 OnCD6體內(nèi)過表達(dá)對炎癥因子表達(dá)的影響
        4.4.9 OnCD6在HKLs中信號通路檢測
    4.5 實(shí)驗(yàn)討論
5 CD6與胞外配體CD166的相互作用探究
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)用魚
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.5 實(shí)驗(yàn)引物
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 實(shí)驗(yàn)用魚及預(yù)處理
        5.3.2 總RNA提取和c DNA合成
        5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析
        5.3.4 OnCD166熒光定量
        5.3.5 OnCD166胞外段原核表達(dá)
        5.3.6 OnCD166多克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)
        5.3.7 OnCD166-ECD與細(xì)菌結(jié)合檢測
        5.3.8 OnCD166-ECD與 PAMPs結(jié)合檢測
        5.3.9 OnCD166-ECD誘導(dǎo)細(xì)菌凝集反應(yīng)檢測
        5.3.10 GST Pull-Down驗(yàn)證OnCD166和OnCD6 相互作用
        5.3.11 OnCD166亞細(xì)胞定位及共定位實(shí)驗(yàn)
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 OnCD166基因克隆與生信分析
        5.4.2 OnCD166 m RNA表達(dá)特征
        5.4.3 OnCD166-ECD原核表達(dá)
        5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗體制備
        5.4.5 OnCD166-ECD參與細(xì)菌結(jié)合
        5.4.6 OnCD166-ECD與 PAMPs結(jié)合
        5.4.7 OnCD166-ECD誘導(dǎo)細(xì)菌凝集反應(yīng)
        5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用結(jié)構(gòu)域確定
        5.4.9 OnCD166 亞細(xì)胞定位及與OnCD6 共定位
    5.5 實(shí)驗(yàn)討論
6 CD6與胞內(nèi)配體的互作及信號通路初探
    6.1 引言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)用魚
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        6.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.4 實(shí)驗(yàn)引物
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析
        6.3.2 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 熒光定量
        6.3.3 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表達(dá)
        6.3.4 抗體封閉實(shí)驗(yàn)
        6.3.5 GSTPull-Down驗(yàn)證OnCD6與Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作
        6.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 羅非魚Syntenin-1 基因克隆及生信分析
        6.4.2 羅非魚LCP2基因克隆和生信分析
        6.4.3 羅非魚TRAF6基因克隆和生信分析
        6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表達(dá)特征
        6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表達(dá)及純化
        6.4.6 抗體封閉實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.7 OnCD6-ICD與 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作
        6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 參與的信號通路
    6.5 實(shí)驗(yàn)討論
7 全文總結(jié)與展望
    7.1 全文總結(jié)
    7.2 后續(xù)展望
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ GST標(biāo)簽包涵體蛋白變性條件下表達(dá)、純化和復(fù)性
附錄Ⅱ His標(biāo)簽包涵體蛋白變性條件下表達(dá)、純化和復(fù)性
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]魚類免疫學(xué)研究進(jìn)展[J]. 唐玫,馬廣智,徐軍.  免疫學(xué)雜志. 2002(S1)
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[2]尼羅羅非魚T細(xì)胞激活相關(guān)基因的功能研究[D]. 甘楨.廣東海洋大學(xué) 2015
[3]棕點(diǎn)石斑魚中草藥免疫增強(qiáng)劑的篩選及其非特異性免疫增強(qiáng)效果研究[D]. 孫曉飛.海南大學(xué) 2014
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[5]紅笛鯛重組激活基因克隆及表達(dá)分析[D]. 張雪利.廣東海洋大學(xué) 2012
[6]對蝦腸道益生菌的篩選與免疫物質(zhì)活性評價(jià)指標(biāo)的建立[D]. 李海兵.中國海洋大學(xué) 2008



本文編號：3183720