我國(guó)淡水珍珠產(chǎn)量自上世紀(jì)80年代初以來(lái)一直處于世界領(lǐng)先地位,三角帆蚌（Hypriosis20cumingii）是最主要育珠蚌。三角帆蚌所產(chǎn)珍珠珠質(zhì)光滑細(xì)膩,顏色鮮艷多樣。珍珠顏色影響珍珠價(jià)值。珍珠顏色受到供片蚌珍珠層顏色的影響。外泌體參與貝殼形成,外泌體是否參與貝殼珍珠層顏色形成值得關(guān)注。本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三角帆蚌紫色（貝殼珍珠層為紫色）與白色（貝殼珍珠層為白色）家系為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)miRNA與蛋白質(zhì)組測(cè)序技術(shù)對(duì)外套膜外泌體在貝殼珍珠層顏色形成過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:1.三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體提取、鑒定及miRNA表達(dá)譜分析首次成功提取三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體。使用電鏡鑒定外泌體形態(tài)為茶托樣,粒徑分布分析表明白色與紫色家系外泌體直徑分別為175.2±5.120nm及176.1±5.4nm。對(duì)兩種外泌體small20RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序與表達(dá)譜分析。通過(guò)與miRbase20V21數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),在白色與紫色家系外套膜外泌體中分別獲得了136個(gè)與159個(gè)miRNA。使用|log2（Fold20change）|≥2,且20p20value≤0.0520的... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 貝殼的形成與結(jié)構(gòu)
    2. 珍珠層顏色研究進(jìn)展
        2.1 金屬元素致色
        2.2 有機(jī)物致色
        2.3 珍珠層結(jié)構(gòu)致色
    3. 外泌體研究進(jìn)展
    4. 本研究的目的與意義
第二章 三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體的提取、鑒定及miRNA表達(dá)譜分析
    第一節(jié) 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌的提取、鑒定
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 外套膜組織外泌體的提取
                1.2.2 外泌體的電鏡鑒定(TEM)
                1.2.3 外泌體的納米顆粒追蹤分析檢測(cè)(NTA)
        2 結(jié)果
            2.1 外泌體電鏡觀察與粒徑分布
        3 討論
    第二節(jié) 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌的miRNA表達(dá)譜分析
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 總RNA的提取
                1.2.2 兩種殼色三角帆蚌外套膜外泌體miRNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
                1.2.3 差異表達(dá)miRNA的qPCR驗(yàn)證
        2 結(jié)果
            2.1 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌體miRNA測(cè)序質(zhì)量分析
            2.2 差異表達(dá)miRNAs分析及qPCR驗(yàn)證
        3 討論
第三章 外泌體miRNA對(duì)三角帆蚌珍珠層顏色形成相關(guān)基因的調(diào)控作用
    第一節(jié) miR-15b調(diào)控三角帆蚌hcApo基因
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建
                1.2.2 293T細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
                1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
                1.2.4 三角帆蚌中miR-15b的抑制
                1.2.5 miR-15b的組織表達(dá)
                1.2.6 hcApo基因的組織定量分析
        2 結(jié)果
            2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析
            2.2 miR-15b與hcApo基因的組織表達(dá)分析
        3 討論
    第二節(jié) miR-4504調(diào)控三角帆蚌HcMitf基因
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建
                1.2.2 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
                1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
                1.2.4 三角帆蚌中miR-4504的抑制
                1.2.5 miR-4504的組織表達(dá)
                1.2.6 HcMitf與HcTyr基因的組織定量分析
                1.2.7 外套膜組織酪氨酸酶活性檢測(cè)
                1.2.8 外套膜組織黑色素含量檢測(cè)
                1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
        2 結(jié)果
            2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析
            2.2 miR-4504、HcMitf及其下游基因HcTyr的組織表達(dá)分析
            2.3 外套膜組織酪氨酸酶活性與黑色素含量
        3 討論
第四章 三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體蛋白組學(xué)分析
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 外套膜組織外泌體提取
            1.2.2 外泌體電鏡鑒定與納米顆粒追蹤分析
            1.2.3 外泌體總蛋白提取
            1.2.4 TMT標(biāo)記
            1.2.5 高效液相色譜分級(jí)
            1.2.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析
            1.2.7 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析
            1.2.8 生物信息學(xué)分析
            1.2.9 通過(guò)PRM驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白
    2 結(jié)果
        2.1 外套膜外泌體的鑒定
        2.2 蛋白質(zhì)譜與功能注釋
        2.3 差異蛋白鑒定與富集分析
        2.4 差異表達(dá)蛋白的PRM驗(yàn)證
    3 討論
第五章 三角帆蚌珍珠層顏色形成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析
    第一節(jié) 三角帆蚌鐵蛋白基因HcFerritin的克隆與表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 總RNA提取以及HcFerritin基因克隆
                1.2.2 HcFerritin基因序列分析
                1.2.3 HcFerritin基因組織特異性表達(dá)分析
                1.2.4 原位雜交
                1.2.5 鐵脅迫對(duì)HcFerritin基因的表達(dá)分析
        2 結(jié)果
            2.1 HcFerritin基因的克隆與序列分析
            2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.3 HcFerritin基因的組織表達(dá)分析
            2.4 原位雜交結(jié)果
            2.5 鐵脅迫后HcFerritin基因的表達(dá)分析
        3 討論
    第二節(jié) 三角帆蚌糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因HcCPOX的克隆與表達(dá)分析
        1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 總RNA提取以及HcCPOX基因克隆
                1.2.2 HcCPOX基因序列分析
                1.2.3 HcCPOX基因組織特異性表達(dá)分析
                1.2.4 原位雜交
                1.2.5 組織糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性檢測(cè)
                1.2.6 RNA干擾
        2 結(jié)果
            2.1 HcCPOX基因的克隆與序列分析
            2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.3 HcCPOX基因的組織表達(dá)分析
            2.4 原位雜交
            2.5 組織糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性檢測(cè)
            2.6 RNA干擾后檢測(cè)
        3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
博士期間科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]三角帆蚌hcSRCR1基因的克隆及在不同殼色選育系中的表達(dá)模式[J]. 李西雷,李卿青,任名棟,白志毅,李家樂(lè).  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2018(11)
[3]馬氏珠母貝（Pinctada20fucata20martensii）PmHEX基因的功能研究[J]. 范閃閃,鄭哲,郝瑞娟,王慶恒,杜曉東.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2019(01)
[4]文蛤糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因克隆及與殼色性狀的相關(guān)性分析[J]. 詹艷玲,董迎輝,何琳,阮文斌,高曉艷,林志華.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2017(07)
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[10]卟啉的生物合成途徑與化學(xué)合成方法的比較[J]. 蘇優(yōu)拉,張逸,李嘉賓,陸軍農(nóng).  大學(xué)化學(xué). 2012(06)

博士論文
[1]人類卟啉癥及貧血的斑馬魚(yú)疾病模型的建立與解析[D]. 張淑青.蘇州大學(xué) 2015
[2]鐵蛋白在蝦夷扇貝新品種“海大金貝”高抗逆性中的作用及機(jī)理研究[D]. 張?jiān)略?中國(guó)海洋大學(xué) 2013
[3]珍珠層的微結(jié)構(gòu)及其中類胡蘿卜素的原位研究[D]. 張剛生.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 2001

碩士論文
[1]三角帆蚌碳酸酐酶基因與珍珠顏色和珍珠形成相關(guān)初步研究[D]. 王芹.上海海洋大學(xué) 2017
[2]三角帆蚌酪氨酸酶相關(guān)基因克隆及對(duì)珍珠層顏色影響研究[D]. 陳夏君.上海海洋大學(xué) 2017
[3]三角帆蚌供片蚌對(duì)珍珠質(zhì)量的影響[D]. 劉越.上海海洋大學(xué) 2013
[4]蝦青素對(duì)馬氏珠母貝的影響研究[D]. 馬孝甜.廣東海洋大學(xué) 2012
[5]三角帆蚌兩種貝殼珍珠質(zhì)顏色對(duì)珍珠顏色影響的研究[D]. 朱文彬.上海海洋大學(xué) 2011
[6]卟啉及金屬卟啉對(duì)珍珠顏色的貢獻(xiàn)及致色機(jī)理研究[D]. 張?zhí)N韜.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（北京） 2006



本文編號(hào)：3178343