魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種具有高毒力的革蘭氏陽性菌,能感染多種淡水和海水魚類,每年給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來數(shù)以億計的損失,近幾年在我國南方羅非魚養(yǎng)殖區(qū)肆虐流行,嚴重阻礙了我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。鑒于單克隆抗體具有高度的特異性和靈敏性等優(yōu)點,在病原檢測方面有著突出的優(yōu)勢,本研究制備了抗羅非魚源無乳鏈球菌單克隆抗體,并利用所生產(chǎn)的的單抗建立的夾心ELISA方法,如下:1.以羅非魚源無乳鏈球菌GD09株滅活全菌抗原作為免疫原免疫6—8周齡的BALB/c小鼠,免疫3-4次并在效價達到1:12800以上時進行細胞融合,用建立的間接ELISA法進行篩選,制備了 9株抗羅非魚源無乳鏈球菌全菌抗原單克隆抗體雜交瘤細胞株,分別命名為4C12、4B5、3A9、3A10、3A12、3C5、1F1、4D12、3D2。經(jīng)鑒定9株雜交瘤細胞染色體計數(shù)為90～110條,均大于親本細胞,亞類鑒定結(jié)果顯示4C12、3A10屬于IgG2a亞類,4B5、4D12 屬于 IgG1 亞類,3A9、3C5、1F1、3A12、3D2 屬于 IgM 亞類;經(jīng)測定 9 株單抗 4C12、4B5... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 文獻綜述
    1.1 無乳鏈球菌概述
    1.2 無乳鏈球菌的危害
    1.3 無乳鏈球菌的診斷方法
        1.3.1 PCR
        1.3.2 LAMP
        1.3.3 生化試驗
        1.3.4 熒光原位雜交（FISH）
    1.4 無乳鏈球菌表面蛋白
        1.4.1 C抗原
        1.4.2 Alp蛋白家族
        1.4.3 β蛋白
        1.4.4 HvgA
        1.4.5 富含絲氨酸重復蛋白（SRR）
        1.4.6 Sip蛋白
        1.4.7 Spb1蛋白
    1.5 鏈球菌毒力因子
        1.5.1 CpsY和CpsD
        1.5.2 M-like protein
        1.5.3 C5a肽酶
        1.5.4 其它毒力因子
    1.6 羅非魚自身抗性與免疫治療
    1.7 鏈球菌單克隆抗體的研究現(xiàn)狀
    1.8 本研究的目的意義
第二章 羅非魚無乳鏈球菌的分離純化鑒定及保存
    2.1 材料與方法
        2.1.1 病料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基及常用溶液配制
        2.1.4 儀器和設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 病原菌分離培養(yǎng)
        2.2.2 形態(tài)特征鑒定
        2.2.3 生理生化特性鑒定
        2.2.4 PCR鑒定
        2.2.5 動物回歸試驗
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 病原菌分離培養(yǎng)
        2.3.2 形態(tài)特征鑒定
        2.3.3 生理生化特性鑒定
        2.3.4 PCR鑒定
        2.3.5 動物回歸試驗結(jié)果
    2.4 討論
第三章 抗羅非魚源無乳鏈球菌單克隆抗體的制備
    3.1 材料
        3.1.1 實驗動物及細胞株
        3.1.2 細菌來源
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 儀器設備及耗材
        3.1.5 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 羅非魚無乳鏈球菌全菌抗原的制備
        3.2.2 抗原濃度的測定（麥氏比濁法）
        3.2.3 動物免疫
        3.2.4 間接ELISA方法的建立
        3.2.5 小鼠血清效價測定
        3.2.6 細胞融合
        3.2.7 陽性雜交瘤細胞的篩選
        3.2.8 陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)
        3.2.9 雜交瘤細胞的凍存與復蘇
        3.2.10 單克隆抗體的制備
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 間接ELISA方法的建立
        3.3.2 免疫小鼠血清效價的測定結(jié)果
        3.3.3 細胞融合
    3.4 討論
        3.4.1 抗原的選擇
        3.4.2 動物免疫
        3.4.3 間接ELISA方法的建立
        3.4.4 細胞融合
第四章 抗羅非魚源無乳鏈球菌單克隆抗體生物學特性的鑒定
    4.1 材料
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 試驗用試劑配制
        4.1.3 主要儀器設備及耗材
    4.2 方法
        4.2.1 單抗雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及部分雜交瘤株小鼠腹水效價的測定
        4.2.2 單抗雜交瘤細胞的染色體分析
        4.2.3 單抗亞類的鑒定
        4.2.4 單抗重鏈、輕鏈驗證
        4.2.5 單抗相對親和力的測定
        4.2.6 單抗的抗原結(jié)合位點鑒定
        4.2.7 單抗雜交瘤細胞的穩(wěn)定性
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 單抗雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及部分雜交瘤株小鼠腹水效價的測定
        4.3.2 單抗雜交瘤細胞的染色體分析
        4.3.3 單克隆抗體亞類的鑒定
        4.3.4 單克隆抗體重鏈、輕鏈分子質(zhì)量測定
        4.3.5 單克隆抗體相對親和力的測定
        4.3.6 單克隆抗體識別抗原表位鑒定結(jié)果
        4.3.7 單克隆抗體雜交瘤細胞的穩(wěn)定性鑒定
    4.4 討論
第五章 雙抗體夾心ELISA法的建立與初步應用
    5.1 材料
        5.1.1 羅非魚陰性陽性樣品
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 試劑的配制
        5.1.4 主要儀器及耗材
    5.2 方法
        5.2.1 正辛酸—飽和硫酸銨法純化腹水單抗
        5.2.2 蛋白G親和層析法純化單克隆抗體
        5.2.3 HRP標記腹水單抗
        5.2.4 酶標抗體活性的鑒定
        5.2.5 酶量、IgG量、酶標記率和克分子比的測定
        5.2.6 雙抗體夾心ELISA法的初步建立
        5.2.7 實驗感染樣本的檢測
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 腹水單抗的正辛酸—飽和硫酸銨法純化
        5.3.2 腹水單抗初提及親和層析純化結(jié)果
        5.3.3 腹水單抗標記結(jié)果
        5.3.4 酶標抗體的活性的確定
        5.3.5 單抗最佳包被濃度及酶標抗體最佳稀釋度的確定
        5.3.6 夾心ELISA方法的條件優(yōu)化
        5.3.7 雙抗體夾心ELISA法檢測陰陽性抗原臨界值的確定
        5.3.8 敏感性實驗
        5.3.9 特異性實驗
        5.3.10 雙抗體夾心ELISA法檢測感染魚不同組織樣品浸出液中鏈球菌的結(jié)果
    5.4 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
申明



本文編號：3162530