遲緩愛德華氏菌是海水養(yǎng)殖魚類的主要致病菌,屬胞內(nèi)寄生菌,傳統(tǒng)抗生素難以防治,本實(shí)驗(yàn)室致力于研究其致病機(jī)制和疫苗的開發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn),通過大腸桿菌重組表達(dá)該病原菌的持家酶果糖1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）,免疫斑馬魚和大菱鲆后,對(duì)Edwardsiella tarda均具有較好的免疫保護(hù)力,是愛德華氏菌病亞單位疫苗開發(fā)的優(yōu)良候選抗原。使用大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素。本文將抗原蛋白FBA在畢赤酵母中進(jìn)行重組表達(dá),以期避免內(nèi)毒素問題并且實(shí)現(xiàn)抗原蛋白FBA大規(guī)模制備,進(jìn)而將其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖新型疫苗開發(fā)中。本工作完成了重組表達(dá)FBA的畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K::fba和GS115-pGAPZαA::fba的構(gòu)建,搖瓶培養(yǎng)條件下檢測甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母GS115-pPIC9K::fba對(duì)FBA蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后重組FBA能被成功誘導(dǎo)表達(dá)。隨后將GS115-pPIC9K::fba經(jīng)5L發(fā)酵罐培養(yǎng),發(fā)酵液上清中FBA的濃度可達(dá)1.06g/L,并通過鎳柱親和層析完成了其純化。對(duì)純化后的重組FBA進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià),其免疫斑馬魚和大菱鲆后均具有較好的免疫保護(hù)效力。并且重組酵母... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖
    1.2 遲緩愛德華氏菌
    1.3 果糖1,6二磷酸醛縮酶FBA
        1.3.1 FBA在糖酵解中的催化作用
        1.3.2 FBA的亞細(xì)胞定位
        1.3.3 FBA的免疫原性
    1.4 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)
        1.4.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)
        1.4.2 畢赤酵母表達(dá)載體
        1.4.3 畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白
        1.4.4 畢赤酵母的發(fā)酵調(diào)控
    1.5 抗原表位的篩選
        1.5.1 抗原表位
        1.5.2 常用抗原表位篩選方法
    1.6 本課題研究意義
第2章 E. tarda抗原蛋白FBA在畢赤酵母中的表達(dá)
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 載體與菌株
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 引物設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理軟件
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 FBA畢赤酵母表達(dá)株的構(gòu)建
        2.3.2 重組畢赤酵母的搖瓶培養(yǎng)和蛋白檢測
        2.3.3 重組畢赤酵母GS115-pPIC9K::fba的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.4 重組FBA蛋白的純化
        2.3.5 Bradford法檢測純化后蛋白濃度
        2.3.6 重組FBA的免疫原性檢測
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 FBA畢赤酵母表達(dá)株的構(gòu)建
        2.4.2 GS1 15-pPIC9K::fba的搖瓶培養(yǎng)和蛋白表達(dá)檢測
        2.4.3 GS1 15-pPIC9K::fba的發(fā)酵罐培養(yǎng)和蛋白檢測
        2.4.4 重組FBA蛋白的親和純化
        2.4.5 重組FBA蛋白免疫原性檢測
    2.5 本章小結(jié)
第3章 E. tarda抗原蛋白FBA的表位篩選
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.2.2 載體和菌株
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.4 引物設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理軟件
    3.3 實(shí)驗(yàn)方案
        3.3.1 構(gòu)建方案
        3.3.2 EIB202基因組的抽提
        3.3.3 重組質(zhì)粒pET28a::△fba的構(gòu)建
        3.3.4 △FBA蛋白的表達(dá)檢測及純化
        3.3.5 △FBA蛋白對(duì)斑馬魚免疫效果的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)
        3.3.6 AFBA蛋白與抗血清反應(yīng)性檢測實(shí)驗(yàn)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 FBA表位在線預(yù)測結(jié)果
        3.4.2 重組質(zhì)粒pET28a::△fba的構(gòu)建
        3.4.3 △FBA蛋白的表達(dá)檢測及純化
        3.4.4 △FBA蛋白對(duì)斑馬魚免疫效果的評(píng)價(jià)
        3.4.5 △FBA蛋白與抗血清反應(yīng)性檢測實(shí)驗(yàn)
    3.5 本章小結(jié)
第4章 FBA蛋白和GAPDH蛋白的融合表達(dá)
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 FBA-GAP融合蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
        4.3.2 FBA-GAP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        4.3.3 FBA-GAP融合蛋白的Western blotting檢測
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 FBA-GAP串聯(lián)蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
        4.4.2 FBA-GAP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]甲醇營養(yǎng)型重組畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白過程的控制與優(yōu)化(英文)[J]. 高敏杰,史仲平.  Chinese Journal of Chemical Engineering. 2013(02)
[2]巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 姚晶,吳正鈞,任婧.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(03)
[3]豬囊尾蚴磷蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及初步應(yīng)用[J]. 蘇彩霞,才學(xué)鵬,韓雪清,駱學(xué)農(nóng),鄭亞東,竇永喜.  生物工程學(xué)報(bào). 2003(04)
[4]遲緩愛德華氏菌胞外產(chǎn)物的細(xì)胞毒性和動(dòng)物致病性[J]. 葛艷,陳懷青,陸承平.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(01)



本文編號(hào)：3149758