遲緩愛德華氏菌是海水養(yǎng)殖魚類的主要致病菌,屬胞內(nèi)寄生菌,傳統(tǒng)抗生素難以防治,本實驗室致力于研究其致病機制和疫苗的開發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn),通過大腸桿菌重組表達該病原菌的持家酶果糖1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）,免疫斑馬魚和大菱鲆后,對Edwardsiella tarda均具有較好的免疫保護力,是愛德華氏菌病亞單位疫苗開發(fā)的優(yōu)良候選抗原。使用大腸桿菌進行重組表達會產(chǎn)生內(nèi)毒素。本文將抗原蛋白FBA在畢赤酵母中進行重組表達,以期避免內(nèi)毒素問題并且實現(xiàn)抗原蛋白FBA大規(guī)模制備,進而將其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖新型疫苗開發(fā)中。本工作完成了重組表達FBA的畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K::fba和GS115-pGAPZαA::fba的構(gòu)建,搖瓶培養(yǎng)條件下檢測甲醇誘導型重組畢赤酵母GS115-pPIC9K::fba對FBA蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲醇誘導后重組FBA能被成功誘導表達。隨后將GS115-pPIC9K::fba經(jīng)5L發(fā)酵罐培養(yǎng),發(fā)酵液上清中FBA的濃度可達1.06g/L,并通過鎳柱親和層析完成了其純化。對純化后的重組FBA進行免疫效果評價,其免疫斑馬魚和大菱鲆后均具有較好的免疫保護效力。并且重組酵母... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖
    1.2 遲緩愛德華氏菌
    1.3 果糖1,6二磷酸醛縮酶FBA
        1.3.1 FBA在糖酵解中的催化作用
        1.3.2 FBA的亞細胞定位
        1.3.3 FBA的免疫原性
    1.4 畢赤酵母表達系統(tǒng)
        1.4.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢
        1.4.2 畢赤酵母表達載體
        1.4.3 畢赤酵母表達的外源蛋白
        1.4.4 畢赤酵母的發(fā)酵調(diào)控
    1.5 抗原表位的篩選
        1.5.1 抗原表位
        1.5.2 常用抗原表位篩選方法
    1.6 本課題研究意義
第2章 E. tarda抗原蛋白FBA在畢赤酵母中的表達
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 載體與菌株
        2.2.2 實驗動物
        2.2.3 實驗試劑
        2.2.4 引物設(shè)計及數(shù)據(jù)處理軟件
    2.3 實驗方法
        2.3.1 FBA畢赤酵母表達株的構(gòu)建
        2.3.2 重組畢赤酵母的搖瓶培養(yǎng)和蛋白檢測
        2.3.3 重組畢赤酵母GS115-pPIC9K::fba的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.4 重組FBA蛋白的純化
        2.3.5 Bradford法檢測純化后蛋白濃度
        2.3.6 重組FBA的免疫原性檢測
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 FBA畢赤酵母表達株的構(gòu)建
        2.4.2 GS1 15-pPIC9K::fba的搖瓶培養(yǎng)和蛋白表達檢測
        2.4.3 GS1 15-pPIC9K::fba的發(fā)酵罐培養(yǎng)和蛋白檢測
        2.4.4 重組FBA蛋白的親和純化
        2.4.5 重組FBA蛋白免疫原性檢測
    2.5 本章小結(jié)
第3章 E. tarda抗原蛋白FBA的表位篩選
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗動物
        3.2.2 載體和菌株
        3.2.3 實驗試劑
        3.2.4 引物設(shè)計及數(shù)據(jù)處理軟件
    3.3 實驗方案
        3.3.1 構(gòu)建方案
        3.3.2 EIB202基因組的抽提
        3.3.3 重組質(zhì)粒pET28a::△fba的構(gòu)建
        3.3.4 △FBA蛋白的表達檢測及純化
        3.3.5 △FBA蛋白對斑馬魚免疫效果的評價實驗
        3.3.6 AFBA蛋白與抗血清反應(yīng)性檢測實驗
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 FBA表位在線預測結(jié)果
        3.4.2 重組質(zhì)粒pET28a::△fba的構(gòu)建
        3.4.3 △FBA蛋白的表達檢測及純化
        3.4.4 △FBA蛋白對斑馬魚免疫效果的評價
        3.4.5 △FBA蛋白與抗血清反應(yīng)性檢測實驗
    3.5 本章小結(jié)
第4章 FBA蛋白和GAPDH蛋白的融合表達
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
    4.3 實驗方法
        4.3.1 FBA-GAP融合蛋白表達菌株的構(gòu)建
        4.3.2 FBA-GAP融合蛋白的誘導表達及純化
        4.3.3 FBA-GAP融合蛋白的Western blotting檢測
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 FBA-GAP串聯(lián)蛋白表達菌株的構(gòu)建
        4.4.2 FBA-GAP融合蛋白的誘導表達及純化
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]甲醇營養(yǎng)型重組畢赤酵母高效表達外源蛋白過程的控制與優(yōu)化(英文)[J]. 高敏杰,史仲平.  Chinese Journal of Chemical Engineering. 2013(02)
[2]巴氏畢赤酵母表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 姚晶,吳正鈞,任婧.  江蘇農(nóng)業(yè)科學. 2012(03)
[3]豬囊尾蚴磷蛋白在畢赤酵母中的表達及初步應(yīng)用[J]. 蘇彩霞,才學鵬,韓雪清,駱學農(nóng),鄭亞東,竇永喜.  生物工程學報. 2003(04)
[4]遲緩愛德華氏菌胞外產(chǎn)物的細胞毒性和動物致病性[J]. 葛艷,陳懷青,陸承平.  中國獸醫(yī)學報. 2000(01)



本文編號：3149758