草魚呼腸孤病毒隸屬于水生呼腸孤病毒屬，是引起草魚出血病的主要病原。該病毒基因組由11條雙鏈RNA組成，共編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白和5個非結(jié)構(gòu)蛋白。GCRV導(dǎo)致宿主細胞融合、凋亡、應(yīng)急顆粒產(chǎn)生等病理變化。GCRV的雙鏈RNA能夠在病毒正常復(fù)制周期避免結(jié)合Dicer并逃逸宿主RNAi抗病毒作用通路。本文利用RACE技術(shù)、Real-time PCR、細胞轉(zhuǎn)染等方法對以下三個方面進行研究：1.草魚Dicer基因的克隆與表達在RNAi介導(dǎo)的沉默機制中, Dicer發(fā)揮著重要的作用。本研究通過同源克隆方法和RACE技術(shù)獲得草魚Dicer cDNA序列,其開放閱讀框為5646bp，編碼1881個氨基酸。草魚Dicer含有其他生物Dicer的所有結(jié)構(gòu)域。在草魚腦、鰓、頭腎、肝臟、脾臟、心臟、肌肉、和腸8個不同組織中,Dicer基因均有分布。GCRV感染CIK細胞條件下，Dicer表達在24h時上調(diào)，與對照組顯著性差異。同樣在Poly（I:C）刺激CIK細胞條件下，Dicer表達在2h時上調(diào)，與對照組顯著性差異。不同組織的時序表達研究結(jié)果顯示,在肝臟中,草魚Dicer在病毒感染12h時表達量開始上調(diào),且與對照組... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

GCRV基因組及其編碼蛋白

圖 2 RNaseIII 家族的結(jié)構(gòu)域和 RNaseIII 基因家族的三種類型Domain organization of RNaseIII gene family and three classes of RNaseIII genes are icer 結(jié)構(gòu)域的功能目前已經(jīng)證明 Helicase 使 Dicer 酶沿著 dsRNA 移動或者使 dsRNA 解鏈于 Dicer 酶的切割。RNaseIII 結(jié)構(gòu)域能夠與底物 dsRNA 結(jié)合，dsRBD 結(jié)剪切 RNA 底物, PAZ 結(jié)構(gòu)域有助于識別 dsRNA 底物并與其相結(jié)合, DU域的功能不明[67]。icer 的功能Dicer 對 miRNA 和 siRNA 的產(chǎn)生中發(fā)揮作用，miRNA 的產(chǎn)生分兩步：胞核中，RNase III Drosha 將 pri-miRNA 轉(zhuǎn)化為 70nt 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 pre-m Pre-miRNA 被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，被 Dicer 切割為 21-23 nt 的成熟 miRNA[6

(9) 向純化柱內(nèi)加入 400μl 純化柱洗滌液。14000rpm, 30s.10)將純化柱連接到一個干凈的 1.5ml 離心管上，直接向純化柱加入 30μl 洗脫緩。在室溫下靜置 1min.(11) 14000rpm, 15s, 用于洗脫質(zhì)粒 DNA。蓋緊離心管的蓋子，將洗脫下來粒 DNA 存儲于-20℃..5.7cDNA 末端快速擴增技術(shù) RACE根據(jù) cDNA 末端序列快速擴增(Rapid Amplification of cDNA End, RACE)試操作說明,從而獲得目的基因的5'端和3'末端cDNA 序列,進而得到其cDNA全列。其操作原理如下：

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3142968