草魚呼腸孤病毒屬于水生呼腸孤病毒屬,是危害草魚最嚴(yán)重的病毒性病原,其中Ⅱ型GCRV為當(dāng)前我國流行最廣的毒株。Ⅱ型GCRV包含11條ds RNA,其中S6編碼的VP4、S11編碼的VP35以及S7編碼的VP56蛋白據(jù)推測(cè)為病毒的外衣殼蛋白,其在病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中起著重要作用并且能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫,對(duì)其開展研究有助于了解Ⅱ型GCRV的致病機(jī)制以及建立免疫學(xué)檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Ⅱ型GCRV外衣殼蛋白基因進(jìn)行了克隆,并對(duì)蛋白進(jìn)行了表達(dá)純化及多克隆抗體制備,分析了外衣殼蛋白的免疫原性,并用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了與其作用的潛在宿主蛋白,本研究包含了以下四個(gè)方面:1.Ⅱ型GCRV外衣殼蛋白基因S6的原核表達(dá),多克隆抗體的制備,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析試驗(yàn)根據(jù)HZ08株S6基因序列,設(shè)計(jì)構(gòu)建p GEX-4t-3-S6和p GBKT7-VP4重組質(zhì)粒的引物,提取感染了GCRV JX02毒株的CIK總RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得約1954bp的S6目的片段。將基因S6克隆到p GEX-4t-3載體中,并轉(zhuǎn)化入Escherichia coli BL21（DE3）中。SDS-PAGE檢測(cè)誘... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 重組蛋白 rVP4 的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的菌體沉淀于98ku位置顯現(xiàn)出明顯的目的蛋白條帶，但在未誘導(dǎo)的菌體中則沒有發(fā)現(xiàn)該目的條帶 (圖2)。由于rVP4主要出現(xiàn)在沉淀中，所以本試驗(yàn)揭示rVP4主要是以包涵體的形式存在。圖2 重組蛋白rVP4的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析M.蛋白質(zhì)marker；1. 未誘導(dǎo)細(xì)菌沉淀；2. 誘導(dǎo)細(xì)菌沉淀；3.誘導(dǎo)細(xì)菌超聲破碎后的上清；4. 誘導(dǎo)細(xì)菌超聲破碎后的沉淀Fig.2 Induced expression and solubility analysis of rVP4 proteinM.protein marker;1.the precipitate of uninduced bacterial control;2.the precipitate of inducedbacterial control;3.the supernatant of induced bacyterial after ultrasonic;4.the precipitate of inducedbacterial after ultrasonic2.4 rVP4 表達(dá)條件的優(yōu)化及純化SDS-PAGE結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，0.1mmol/L 濃度的IPTG誘導(dǎo)時(shí)，rVP4的目標(biāo)條帶較為明顯，證明rVP4能達(dá)到較高的表達(dá)量；而隨著IPTG濃度提高時(shí)目標(biāo)條帶并無明顯的變化，證明rVP4的表達(dá)量并無顯著性增減，所以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前蛋白誘導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)，把rVP4的IPTG濃度定為0.3mmol/L即能夠達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果（圖3）。圖 3 不同濃度 IPTG 對(duì) rVP4 的誘導(dǎo)效果M.蛋白質(zhì)marker；1.未誘導(dǎo)菌體的沉淀；2. 0.1mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；3. 0.3mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；4. 0.5mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；5. 0.7mm濃度誘?

證明rVP4能達(dá)到較高的表達(dá)量；而隨著IPTG濃度提高時(shí)目標(biāo)條帶并無明顯的變化，證明rVP4的表達(dá)量并無顯著性增減，所以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前蛋白誘導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)，把rVP4的IPTG濃度定為0.3mmol/L即能夠達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果（圖3）。圖 3 不同濃度 IPTG 對(duì) rVP4 的誘導(dǎo)效果M.蛋白質(zhì)marker；1.未誘導(dǎo)菌體的沉淀；2. 0.1mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；3. 0.3mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；4. 0.5mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀；5. 0.7mm濃度誘導(dǎo)的菌體沉淀

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]桃拉綜合癥病毒和草魚呼腸孤病毒外殼蛋白抗體的制備與分析[D]. 楊倩.上海海洋大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3122889