發(fā)布時間：2021-04-07 05:25

　　草魚呼腸孤病毒屬于水生呼腸孤病毒屬,是危害草魚最嚴重的病毒性病原,其中Ⅱ型GCRV為當前我國流行最廣的毒株。Ⅱ型GCRV包含11條ds RNA,其中S6編碼的VP4、S11編碼的VP35以及S7編碼的VP56蛋白據(jù)推測為病毒的外衣殼蛋白,其在病毒進入細胞過程中起著重要作用并且能夠誘導宿主產生適應性免疫,對其開展研究有助于了解Ⅱ型GCRV的致病機制以及建立免疫學檢測方法。本實驗對Ⅱ型GCRV外衣殼蛋白基因進行了克隆,并對蛋白進行了表達純化及多克隆抗體制備,分析了外衣殼蛋白的免疫原性,并用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了與其作用的潛在宿主蛋白,本研究包含了以下四個方面:1.Ⅱ型GCRV外衣殼蛋白基因S6的原核表達,多克隆抗體的制備,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析試驗根據(jù)HZ08株S6基因序列,設計構建p GEX-4t-3-S6和p GBKT7-VP4重組質粒的引物,提取感染了GCRV JX02毒株的CIK總RNA,采用RT-PCR技術擴增獲得約1954bp的S6目的片段。將基因S6克隆到p GEX-4t-3載體中,并轉化入Escherichia coli BL21（DE3）中。SDS-PAGE檢測誘... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

6基因PCR擴增產物電泳圖

2.3 重組蛋白 rVP4 的誘導表達及可溶性分析SDS-PAGE結果顯示，經(jīng)誘導的菌體沉淀于98ku位置顯現(xiàn)出明顯的目的蛋白條帶，但在未誘導的菌體中則沒有發(fā)現(xiàn)該目的條帶 (圖2)。由于rVP4主要出現(xiàn)在沉淀中，所以本試驗揭示rVP4主要是以包涵體的形式存在。圖2 重組蛋白rVP4的誘導表達及可溶性分析M.蛋白質marker；1. 未誘導細菌沉淀；2. 誘導細菌沉淀；3.誘導細菌超聲破碎后的上清；4. 誘導細菌超聲破碎后的沉淀Fig.2 Induced expression and solubility analysis of rVP4 proteinM.protein marker;1.the precipitate of uninduced bacterial control;2.the precipitate of inducedbacterial control;3.the supernatant of induced bacyterial after ultrasonic;4.the precipitate of inducedbacterial after ultrasonic2.4 rVP4 表達條件的優(yōu)化及純化SDS-PAGE結果對比發(fā)現(xiàn)，0.1mmol/L 濃度的IPTG誘導時，rVP4的目標條帶較為明顯，證明rVP4能達到較高的表達量；而隨著IPTG濃度提高時目標條帶并無明顯的變化，證明rVP4的表達量并無顯著性增減，所以根據(jù)本實驗室之前蛋白誘導經(jīng)驗，把rVP4的IPTG濃度定為0.3mmol/L即能夠達到很好的誘導效果（圖3）。圖 3 不同濃度 IPTG 對 rVP4 的誘導效果M.蛋白質marker；1.未誘導菌體的沉淀；2. 0.1mm濃度誘導的菌體沉淀；3. 0.3mm濃度誘導的菌體沉淀；4. 0.5mm濃度誘導的菌體沉淀；5. 0.7mm濃度誘?

證明rVP4能達到較高的表達量；而隨著IPTG濃度提高時目標條帶并無明顯的變化，證明rVP4的表達量并無顯著性增減，所以根據(jù)本實驗室之前蛋白誘導經(jīng)驗，把rVP4的IPTG濃度定為0.3mmol/L即能夠達到很好的誘導效果（圖3）。圖 3 不同濃度 IPTG 對 rVP4 的誘導效果M.蛋白質marker；1.未誘導菌體的沉淀；2. 0.1mm濃度誘導的菌體沉淀；3. 0.3mm濃度誘導的菌體沉淀；4. 0.5mm濃度誘導的菌體沉淀；5. 0.7mm濃度誘導的菌體沉淀

【參考文獻】：
期刊論文
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[10]一株草魚呼腸孤病毒檢測用單克隆抗體的制備及其特性[J]. 楊倩,曹海鵬,和永杏,姜有聲,呂利群.  中國免疫學雜志. 2012(03)

碩士論文
[1]桃拉綜合癥病毒和草魚呼腸孤病毒外殼蛋白抗體的制備與分析[D]. 楊倩.上海海洋大學 2012



本文編號：3122889