本論文以凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）為研究對象,運用莖環(huán)法克隆了凡納濱對蝦的9個microRNA;通過注射副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）研究9個microRNA的表達(dá)情況,根據(jù)表達(dá)情況,從中篩選了3個表達(dá)差異較大的microRNA,即miR-182-5p、miR-184和miR-750;并通過注射microRNA mimics和inhibitor影響3個microRNA（miR-182-5p、miR-184和miR-750）的表達(dá)來檢測其對細(xì)胞凋亡、活性氧含量（ROS）、酯酶等免疫指標(biāo)的影響。研究結(jié)果如下:1.注射副溶血弧菌1.5 h后,let-7a-5p、miR-107、miR-184、miR-184-3p、miR-375、miR-375-3p和miR-750的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上調(diào),于24 h達(dá)到峰值;注射副溶血弧菌3 h后,miR-7和miR-182-5p也開始顯著上調(diào),并持續(xù)到實驗結(jié)束。檢測miR-182-5p、miR-184和miR-750在不同組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-182-5p、miR-184和miR-750... 

【文章來源】：廣東海洋大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

microRNA生物合成過程圖(Liuetal.,2008)

?2000r離心10min，去掉上清，加入預(yù)冷無水乙醇1mL洗滌沉淀，倒去上清液，加入75%預(yù)冷無水乙醇1mL洗滌沉淀，倒去上清液，再加入預(yù)冷無水乙醇1mL洗滌沉淀，倒去上清液，4℃12000r離心1min，倒置晾干；加入20μLRNasefreeH2O，冰上靜置到沉淀溶解（最多5min）。提取的總RNA質(zhì)量和濃度通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropND-2000超微量分光光度計進(jìn)行檢測，確保RNA質(zhì)量和濃度達(dá)到PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。2.2.4引物、cDNA合成及PCR擴(kuò)增根據(jù)高通量測序所得microRNA成熟序列，用DNAMAN7.0軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增所需的microRNA莖環(huán)引物（RT引物，圖2-1），莖環(huán)序列為(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG–3’)，取microRNA成熟體3’端末端8個堿基的反向互補序列添加到莖環(huán)序列3’端，使其3’端暴露出發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)。將設(shè)計好的莖環(huán)引物送至上海生工生物公司合成，使用RNasefreedH2O稀釋至1μM，于-20℃保存?zhèn)溆�。圖2-1莖環(huán)引物結(jié)構(gòu)示意圖Fig2-1StructureofLoopprimer檢測合格的總RNA利用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A），按照說明書方案進(jìn)行cDNA合成，使用表2-1體系配制孵育溶液。PCR儀42℃孵育2min，4℃保存。按照表2-2體系配制反轉(zhuǎn)錄溶液。PCR儀37℃孵育15min，85℃5s滅活，-20℃保存。取肝胰臟cDNA原液稀釋10倍后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系按照表2-3配制。

凡納濱對蝦免疫相關(guān)microRNA的克隆與功能分析12圖2-2對蝦8個組織的總RNA電泳條帶Fig2-2TotalRNAelectrophoresisbandsin8tissuesofshrimp（M:DNAmarkerDS2000,1:眼柄,2:鰓,3:心臟,4:肝胰臟,5:胃,6:腸道,7:肌肉,8:血淋巴）(M:DNAmarkerDS2000,1:eyestalk,2:gill,3:heart,4:hepatopancrease,5:stomach,6:intestine,7:muscle,8:hemocyte)取PCR產(chǎn)物5μL，使用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物長度，結(jié)果表明9個microRNA|的PCR產(chǎn)物電泳條帶明亮清晰，長度不超過100bp（圖2-3），符合預(yù)期長度，可以送測。測序結(jié)果表明，所選的9個microRNA序列與文庫中的序列大致相同，可用于進(jìn)一步的實驗。圖2-3PCR產(chǎn)物電泳圖Fig2-3PCRproductelectrophoresis（A:實驗組，B:空白對照；M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:miR-184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA）(A:Test，B:Control;M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA)2.4討論利用莖環(huán)法克隆microRNA具有特異性高、操作簡便和成本低廉等特點[64]，

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本文編號：3091836