發(fā)布時(shí)間：2021-03-09 08:20

　　本試驗(yàn)以海南分離株羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板,克隆并原核表達(dá)α-烯醇化酶蛋白,并應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析。通過(guò)α-烯醇化酶活力,纖溶酶原綁定活力確定表達(dá)重組蛋白具有活性。探究α-烯醇化酶在無(wú)乳鏈球菌的定位和α-烯醇化酶粘附EPC細(xì)胞的性質(zhì),初步確定其作為亞單位候選疫苗的可能性。用表達(dá)的重組蛋白作為抗原,進(jìn)行小鼠體內(nèi)免疫試驗(yàn),探究其對(duì)小鼠的免疫保護(hù)率。通過(guò)本試驗(yàn),擬對(duì)無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶生物學(xué)特性有進(jìn)一步了解,并為制備具有交叉保護(hù)力的抗無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。首先,對(duì)無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶進(jìn)行克隆,成功獲得含陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-α-Eno的克隆載體。并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆的α-烯醇化酶的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列含一個(gè)烯醇化酶樣結(jié)構(gòu)域,不含跨膜區(qū),且沒(méi)有信號(hào)肽序列,是一個(gè)疏水蛋白。選取10種不同的致病鏈球菌以及4株無(wú)乳鏈球菌分離株的α-烯醇化酶氨基酸序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的10種鏈球菌之間以及4株無(wú)乳鏈球菌分離株之間,α-烯醇化酶具有較高的同源性。對(duì)比無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列與海豚鏈球菌、肺炎鏈球... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述及目的意義
    1 無(wú)乳鏈球菌
        1.1 概述
        1.2 傳播途徑
        1.3 患病癥狀
        1.4 血清分型
        1.5 致病機(jī)制
        1.6 毒力因子
            1.6.1 莢膜多糖
            1.6.2 唾液酸
            1.6.3 CAMP因子
            1.6.4 表面蛋白
    2 α-烯醇化酶
        2.1 概述
        2.2 纖溶酶原綁定活力
        2.3 細(xì)胞表面定位
        2.4 其他功能
    3 目的意義
第二章 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶的克隆和生物信息學(xué)分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試劑載體
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 α -烯醇化酶基因的擴(kuò)增
        2.2 α-烯醇化酶基因的克隆
        2.3 α-烯醇化酶基因序列特性分析
    3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.1 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶的克隆
        3.2 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列分析
    4 分析與討論
第三章 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶的表達(dá)和純化
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試劑載體
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 α-烯醇化酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        2.4 重組蛋白的純化
    3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.1 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶的表達(dá)
        3.3 重組蛋白的純化
    4 分析與討論
第四章 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶的生物學(xué)活性
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 試劑菌株
        1.3 主要儀器
        1.4 主要試劑配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 重組蛋白的復(fù)性
        2.2 重組蛋白酶活性測(cè)定
        2.3 重組α-烯醇化酶綁定纖溶酶原
        2.4 α-烯醇化酶重組蛋白抗體的制備
        2.5 無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶定位
        2.6 免疫熒光檢測(cè)α-烯醇化酶粘附EPC細(xì)胞
        2.7 α-烯醇化酶對(duì)EPC細(xì)胞的粘附率
    3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.1 重組α-烯醇化酶酶活力測(cè)定
        3.2 重組α-烯醇化酶綁定纖溶酶原
        3.3 抗血清的制備和檢測(cè)
        3.4 GBS α-烯醇化酶定位
        3.5 α-烯醇化酶粘附EPC細(xì)胞
        3.6 α-烯醇化酶對(duì)EPC細(xì)胞的粘附率
    4 分析與討論
        4.1 重組蛋白烯醇化酶活力
        4.2 α-烯醇化酶綁定纖溶酶原
        4.3 α-烯醇化酶表面定位和粘附
        4.4 α-烯醇化酶作為預(yù)防無(wú)乳鏈球菌病的候選抗原
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]海豚鏈球菌C5a肽酶功能活性區(qū)域表達(dá)及其對(duì)斑點(diǎn)叉尾（魚(yú)回）（Ictalurus punctatus）的免疫保護(hù)作用[J]. 鄭宗林,汪開(kāi)毓,肖孟瑋,王均,李嵐敏,賀揚(yáng),陳德芳,黃凌遠(yuǎn).  海洋與湖沼. 2013(05)
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[9]包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展[J]. 方敏,黃華樑.  生物工程學(xué)報(bào). 2001(06)
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本文編號(hào)：3072569