本實驗利用RACE-PCR技術克隆了蛤仔HSP60基因全長,結(jié)果表明,蛤仔HSP60c DNA全長1777bp（含ploy A序列）,Gen Bank登錄號:KT987978,包括1728bp的開放閱讀框（ORF）,21bp的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）和49bp的3’端非編碼區(qū)（3’-UTR）,編碼575個氨基酸,推導蛋白分子量（Mw）為61.25 k Da,等電點（p I）為5.04,N末端無信號肽結(jié)構(gòu),序列同源性比對發(fā)現(xiàn)該基因與已知的HSP60基因序列同源性較高（80%）。本研究首次成功克隆了菲律賓蛤仔的HSP60基因全長,為進一步深入研究蛤仔的抗逆機理及其遺傳改良奠定了基礎。采用實時熒光定量PCR技術,對HSP40、60、90基因在野生及3種殼色品系（海洋橙、斑馬、白蛤）蛤仔的血細胞、閉殼肌、外套膜、足、鰓和消化腺中的表達情況進行了研究。結(jié)果顯示:HSP40、60、90在野生和3種殼色蛤仔不同組織均有表達。以外套膜中的表達量為對照組,其中,HSP40基因在野生和3種殼色鰓組織中表達水平最高（p<0.01）,而在閉殼肌中的表達水平最低;HSP60基因在野生、海洋橙和斑馬蛤... 

【文章來源】：大連海洋大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 我國貝類養(yǎng)殖現(xiàn)狀和存在問題
    1.2 熱休克蛋白的分類及生物學功能
    1.3 研究進展
    1.4 研究目的及意義
第二章 菲律賓蛤仔HSP60基因的克隆及表達分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 蛤仔總RNA的提取
        2.2.2 HSP60基因c DNA序列全長獲得
        2.2.3 凝膠回收、連接和轉(zhuǎn)化
        2.2.4 蛤仔HSP60 c DNA序列的生物信息學分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 RNA質(zhì)量檢測
        2.3.2 5’-和 3’-RACE產(chǎn)物檢測
        2.3.3 蛤仔HSP60基因的生物信息學分析結(jié)果
    2.4 蛤仔HSP60表達分析
        2.4.1 實驗材料
        2.4.2 樣品處理及組織樣提取
        2.4.3 RNA提取
        2.4.4 反轉(zhuǎn)錄
        2.4.5 引物設計
        2.4.6 熒光實時定量PCR條件的優(yōu)化
        2.4.7 數(shù)據(jù)處理方法
    2.5 實驗結(jié)果
        2.5.1 總RNA提取結(jié)果
        2.5.2 標準曲線的建立
        2.5.3 蛤仔HSP60基因組織特異性表達結(jié)果
        2.5.4 野生蛤仔HSP60基因低鹽脅迫后的表達規(guī)律分析
        2.5.5 野生蛤仔HSP60基因高溫脅迫后的表達規(guī)律分析
        2.5.6 野生蛤仔HSP60基因低溫脅迫后的表達規(guī)律分析
    2.6 討論
第三章 HSPS家族（40、60、90）基因啟動子的克隆及初步分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 蛤仔總DNA的提取
        3.1.2 酶切基因組DNA
        3.1.3.酶切后DNA的純化
        3.1.4 染色體步移接頭制備
        3.1.5 連接染色體步移接頭
        3.1.6 啟動子區(qū)引物設計
        3.1.7 啟動子區(qū)擴增
        3.1.8 啟動子序列分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1DNA樣品檢測
        3.2.2 酶切基因組DNA檢測
        3.2.3 啟動子序列分析
    3.3 討論
第四章 蛤仔不同殼色品系在低鹽脅迫下HSPS家族（40、60、90）基因表達分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 低鹽脅迫處理及取樣
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 實驗儀器
        4.1.4 實驗方法
        4.1.5 熒光定量引物設計
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 HSPs組織特異性表達
        4.2.2 低鹽脅迫下HSPs在不同殼色蛤仔中的表達規(guī)律分析
        4.2.3 低鹽脅迫下不同殼色蛤仔中HSPs的表達規(guī)律分析
    4.3 討論
第五章 蛤仔不同殼色品系在溫度脅迫下HSPS家族（40、60、90）基因表達分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 高溫脅迫處理及取樣
        5.1.2 低溫脅迫處理及取樣
        5.1.3 實驗試劑
        5.1.4 實驗儀器
        5.1.5 實驗方法
        5.1.6 熒光定量引物設計
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 高溫脅迫下HSPs在不同殼色蛤仔中的表達規(guī)律分析
        5.2.2 高溫脅迫下HSPs在不同殼色蛤仔中的表達規(guī)律分析
        5.2.3 低溫脅迫下HSPs在不同殼色蛤仔中的表達規(guī)律分析
        5.2.4 低溫脅迫下不同殼色蛤仔中HSPs的表達規(guī)律分析
    5.3 討論
結(jié)論
參考文獻
攻讀碩士期間發(fā)表的學術論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]蝦夷扇貝熱休克蛋白60基因克隆及表達特性研究[J]. 孔繁東,史井運,鮑相渤,高祥剛,赫崇波,劉衛(wèi)東.  生物技術通報. 2015(10)
[2]三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達分析[J]. 吳圣楠,劉大偉,劉毅,胡寶慶,張建強,王艷,王婷.  水生生物學報. 2014(05)
[3]馬氏珠母貝熱休克蛋白HSP60基因的克隆與表達分析[J]. 王志新,梁海鷹,杜曉東,黃榮蓮,鄧岳文,王慶恒,焦鈺.  廣東海洋大學學報. 2013(06)
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[6]不同殼色菲律賓蛤仔免疫機能的比較研究[J]. 丁鑒鋒,楊霏,閆喜武,楊鳳,趙立強,張國范.  大連海洋大學學報. 2012(05)
[7]真蛸熱休克蛋白90基因（HSP90）的克隆及表達[J]. 孫田田,蘇永全,洪婧妮,鄔陽,張曼,毛勇.  水產(chǎn)學報. 2012(09)
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碩士論文
[1]三疣梭子蟹熱休克蛋白HSP60和HSP90α的鹽度適應相關性研究[D]. 覃燁.上海海洋大學 2012
[2]中日貝類產(chǎn)業(yè)發(fā)展與管理比較研究[D]. 王靖陶.中國海洋大學 2010



本文編號：3050819