殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida,As）是一類重要的咸淡水養(yǎng)殖動物病原菌,主要引起鮭鱒魚類如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、金鱒（Oncorhynchus mykiss）和大西洋鮭（Salmo salar）等癤瘡病及潰瘍病,被感染魚體死亡率高影響范圍廣,并且其宿主范圍在逐年擴大,嚴重制約了中國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。目前,中國一般采用化學藥物及各類抗生素防治殺鮭氣單胞菌,抗生素藥物的使用容易導致病原菌出現(xiàn)交叉耐藥反應,同時也使人類面臨環(huán)境污染及食品安全問題。疫苗是防治殺鮭氣單胞菌的最有效方法,在國外,采用接種商業(yè)化疫苗方法預防此菌感染已取得較好的保護效果。因而針對虹鱒殺鮭氣單胞菌開展免疫防控研究具有重要意義。本文選取蜂膠佐劑和弗氏完全佐劑分別添加到殺鮭氣單胞菌滅活疫苗中,然后免疫虹鱒,評價對的虹鱒相對免疫保護率,并采集虹鱒肝、脾臟、頭腎和鰓組織用于RNA的提取,分析疫苗對免疫相關基因表達的影響,以期獲得具有良好免疫效果的佐劑聯(lián)合疫苗。本文主要內(nèi)容如下:第一部分:從本實驗室保藏的2014-2015年分離自大西洋鮭和虹鱒等體內(nèi)的氣單胞菌50株,結(jié)合革蘭... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1.1 國內(nèi)外虹鱒（Oncorhynchus mykiss）養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.2 殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）主要特征
    1.3 魚用佐劑研究進展
        1.3.1 佐劑分類
        1.3.2 佐劑的作用機制
        1.3.3 蜂膠佐劑
    1.4 細胞因子
        1.4.1 白細胞介素（Interlenkkin，IL）
        1.4.2 干擾素（Interferon，IFN）
    1.5 主要組織相容性復合物（MHC）
    1.6 T細胞表面受體
    1.7 免疫球蛋白（Immunoglobulin）
    1.8 本研究的目的和意義
第二章 我國現(xiàn)行殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及特性研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察
        2.2.2 生理生化鑒定
        2.2.3 16SrRNA序列測定
        2.2.4 fstA序列測定
    2.3 殺鮭氣單胞菌血清型分析
        2.3.1 抗原制備
        2.3.2 免疫
    2.4 殺鮭氣單胞菌血清學分析
    2.5 殺鮭氣單胞疫苗候選株的篩選
    2.6 實驗結(jié)果
        2.6.1 菌株的形態(tài)特征
        2.6.2 生理生化特性
        2.6.3 16SrRNA序列的PCR擴增及比對結(jié)果
        2.6.4 fstA序列的PCR擴增及比對結(jié)果
        2.6.5 殺鮭氣單胞菌血清型結(jié)果
        2.6.6 疫苗候選株篩選結(jié)果
    2.7 討論
第三章 殺鮭氣單胞菌SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要試劑與材料
        3.1.2 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 引物設計與合成
        3.2.2 引物特異性檢測
        3.2.3 制備質(zhì)粒標準品
        3.2.4 標準曲線的建立、靈敏度及重復性分析
        3.2.5 SYBR-GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的應用
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 引物特異性檢測
        3.3.2 SYBR GreenⅠReal-time PCR標準曲線的建立
        3.3.3 靈敏度檢測
        3.3.4 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的重復性分析
        3.3.5 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法應用
    3.4 討論
第四章 不同佐劑殺鮭氣單胞菌滅活疫苗對虹鱒免疫效果的研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗菌株
        4.1.2 實驗虹鱒
        4.1.3 蜂膠與弗氏完全佐劑
        4.1.4 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 實驗虹鱒暫養(yǎng)
        4.2.2 殺鮭氣單胞菌疫苗的制備
        4.2.3 疫苗無菌檢驗和安全性檢驗
        4.2.4 虹鱒半致死劑量（LD50）測定
        4.2.5 分組、免疫與采樣
        4.2.6 攻毒感染與免疫相對保護率
        4.2.7 RNA提取及cDNA合成
        4.2.8 熒光定量PCR所用引物的設計與合成
        4.2.9 熒光定量PCR檢測
        4.2.10 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 疫苗無菌檢驗和安全性檢驗
        4.3.2 虹鱒LD50計算
        4.3.3 免疫相對保護率RPS
        4.3.4 熒光定量PCR所用引物的獲得
        4.3.5 IL-8 在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.6 IL-1β在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.7 MHCⅠ在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.8 IFN-γ在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.9 CD8在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.10 IgM在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
        4.3.11 IgT在肝、脾臟、頭腎和鰓中的表達
    4.4 討論
        4.4.1 蜂膠佐劑與弗氏完全佐劑對虹鱒免疫效果的分析
        4.4.2 細胞因子類相關基因的表達分析
        4.4.3 細胞表面分子相關基因的表達分析
        4.4.4 免疫球蛋白IgM和IgT基因的表達分析
結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位論文期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]紅鰭東方鲀干擾素γ基因的原核表達[J]. 馬普,孫賽紅,王玉芳,李慧,劉海映,姜志強,仇雪梅,劉洋,張濤,王秀利.  生物技術通報. 2015(12)
[2]不同佐劑對大鯢嗜水氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果[J]. 楊星,張美彥,周勇,范玉頂,曾令兵.  水生態(tài)學雜志. 2015(05)
[3]1株烏鱧源殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的分離與鑒定[J]. 周冬仁,羅毅志,杭小英,施偉達,葉雪平.  海洋湖沼通報. 2015(03)
[4]魚類MHC及其基因的研究進展[J]. 耿昕穎,王家禎,王巍,單曉楓,馬紅霞,高云航.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2015(25)
[5]蜂膠作為動物疫苗佐劑的研究及應用[J]. 宋曉明,孫海芳,孫旭東,南慧靜.  山東畜牧獸醫(yī). 2015(03)
[6]大西洋鮭殺鮭氣單胞菌無色亞種的分離鑒定和致病性研究[J]. 李紹戊,王荻,連浩淼,盧彤巖,劉紅柏,尹家勝.  水生生物學報. 2015(01)
[7]鯉魚殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 王海娟,王利.  中國畜牧獸醫(yī). 2015(01)
[8]患病細鱗魚殺鮭氣單胞菌的分離與鑒定[J]. 劉寧,時曉,杜迎春,周杰瓏,劉建宏,何宏軒.  淡水漁業(yè). 2015(01)
[9]蜂膠佐劑在獸用疫苗中的應用[J]. 王凱,何天駿,胡福良.  動物醫(yī)學進展. 2013(10)
[10]大黃魚白細胞介素8基因克隆及特征分析[J]. 王亞芳,薛良義.  生物信息學. 2013(03)

碩士論文
[1]甘肅金鱒部分形態(tài)性狀對體質(zhì)量的影響以及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因的SNPs與生長性狀的關聯(lián)分析[D]. 楊建寶.甘肅農(nóng)業(yè)大學 2012



本文編號：3040536