發(fā)布時(shí)間：2021-02-01 22:58

　　溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是水產(chǎn)病害中最常見的細(xì)菌病原之一,可以感染魚、蝦、貝等多種水生動(dòng)物,對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。新近的研究表明,Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）在溶藻弧菌生物膜形成、鞭毛合成和細(xì)胞毒力等致病相關(guān)功能中可能發(fā)揮了重要作用,共包括TssJ、TssM和TssL等13個(gè)核心亞基。其中,TssJ是一個(gè)通過N末端�；陌腚装彼釟埢^定在外膜上的外膜脂蛋白,并證實(shí)在大腸桿菌的T6SS組裝中扮演了非常重要的角色,迄今未見關(guān)于溶藻弧菌tssJ的功能研究。溶藻弧菌HN08155為本實(shí)驗(yàn)室保存的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌株,本文擬采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)定及生物信息學(xué)分析,確定HN08155及其突變株△tssJ的基因差異表達(dá)情況,并制備TssJ的多克隆抗體,為闡明溶藻弧菌tssJ的功能奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)溶藻弧菌野生株HN08155及其突變株△tssJ的生物膜形成初期的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究。經(jīng)過拼接與注釋共獲得3600條Unigene。對(duì)兩菌株的基因表達(dá)量分析,共獲得180個(gè)基因差異表達(dá),其中84個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào),96個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)。這些差異表達(dá)基因主要包... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 溶藻弧菌
    2 T6SS與TssJ蛋白
    3 轉(zhuǎn)錄組及其研究方法
        3.1 轉(zhuǎn)錄組
        3.2 轉(zhuǎn)錄組研究方法
            3.2.1 基因芯片
            3.2.2 表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）技術(shù)
            3.2.3 RNA-Seq技術(shù)
    4 原核表達(dá)載體
    5 研究目的及意義
    6 技術(shù)路線
        6.1 溶藻弧菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)路線圖
        6.2 tssJ原核表達(dá)及多克隆抗體制備技術(shù)路線
第二章 溶藻弧菌野生株和突變株△tssJ的差異表達(dá)序列分析
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株
        2.2 主要試劑材料及儀器
            2.2.1 主要試劑材料
            2.2.2 主要儀器
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 提取RNA時(shí)間確定
        3.2 總RNA的提取
        3.3 RNA文庫(kù)構(gòu)建
        3.4 文庫(kù)質(zhì)量控制
        3.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        3.6 轉(zhuǎn)錄組分析
        3.7 熒光定量PCR（RT-PCR）
    4 結(jié)果與分析
        4.1 總RNA濃度測(cè)定及質(zhì)控檢測(cè)
        4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)
        4.3 數(shù)據(jù)組裝結(jié)果
            4.3.1 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)
            4.3.2 測(cè)序結(jié)果與組裝結(jié)果的比對(duì)統(tǒng)計(jì)
        4.4 差異表達(dá)分析
            4.4.1 差異表達(dá)基因篩選
        4.5 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析
            4.5.1 差異表達(dá)基因GO功能富集
            4.5.2 差異表達(dá)基因COG分類
            4.5.3 差異基因的KEGG富集分析
        4.6 RT-PCR結(jié)果
    5 討論
第三章 溶藻弧菌tssJ基因原核表達(dá)及多克隆抗體制備
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.3 主要試劑材料及儀器
            2.3.1 主要試劑材料
            2.3.2 主要儀器
        2.4 常用溶液配制
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 tssJ基因的獲得
            3.1.1 WT基因組DNA提取
            3.1.2 目的片段擴(kuò)增
            3.1.3 感受態(tài)細(xì)胞制備
            3.1.4 溶藻弧菌tssJ基因與T載體連接
            3.1.5 T-tssJ的轉(zhuǎn)化
            3.1.6 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
        3.2 表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
            3.2.1 pET32a質(zhì)粒處理
            3.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
            3.2.3 重組質(zhì)粒篩選與鑒定
        3.3 tssJ基因的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4 SDS-PAGE分析
        3.5 tssJ基因表達(dá)產(chǎn)物大量表達(dá)及純化
            3.5.1 tssJ基因表達(dá)產(chǎn)物大量表達(dá)
            3.5.2 目的蛋白純化
        3.6 多克隆抗體制備
        3.7 抗體效價(jià)測(cè)定
    4 結(jié)果
        4.1 tssJ基因的擴(kuò)增
        4.2 表達(dá)載體構(gòu)建與檢測(cè)
        4.3 tssJ基因表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析
        4.4 tssJ基因表達(dá)產(chǎn)物的純化
        4.5 抗體效價(jià)的檢測(cè)
    5 討論
第四章 結(jié)論
中英文縮略詞表
參考文獻(xiàn)
作者在讀期間發(fā)表論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]溶藻弧菌HY9901血紅素結(jié)合蛋白HutB的原核表達(dá)及純化[J]. 薛麗麗,龐歡瑛,黃郁蔥,吳灶和,簡(jiǎn)紀(jì)常,周澤軍.  廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(03)
[2]豬STAT-1α基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備[J]. 李延生,劉誠(chéng),張珂,李曉寧,李曉泉,尹珊,謝琳娟,何曉霞,羅揚(yáng),鐘桃珍,羅廷榮.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2014(01)
[3]轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù):RNA-Seq及其應(yīng)用[J]. 祁云霞,劉永斌,榮威恒.  遺傳. 2011(11)
[4]新一代高通量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析[J]. 王曦,汪小我,王立坤,馮智星,張學(xué)工.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2010(08)
[5]海州香薷金屬硫蛋白（EhMT1）的原核表達(dá)和純化及其多克隆抗體的制備[J]. 王娟,王桂萍,張紅生,夏妍,沈振國(guó).  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(04)
[6]鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性與細(xì)菌生物膜的相互關(guān)系[J]. 丁莉莎,王瑤.  微生物學(xué)報(bào). 2009(04)
[7]人SUMO-1基因原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備與鑒定[J]. 宋振,王劼,安寧,楊振,雷鳴,郭澤坤.  免疫學(xué)雜志. 2009(02)
[8]EST分子標(biāo)記開發(fā)研究進(jìn)展[J]. 陳全求,詹先進(jìn),藍(lán)家樣,黃云.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2008(09)
[9]應(yīng)用寡核苷酸芯片分析水稻花序相關(guān)基因在花序發(fā)育中的表達(dá)譜[J]. 李援亞,張?jiān)茖O,杜娟,高志勇,張永彪,王璐.  遺傳. 2003(06)

博士論文
[1]兩株鰻弧菌全基因組序列測(cè)定及轉(zhuǎn)錄組比較分析[D]. 李貴陽(yáng).中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所） 2011
[2]丹參道地藥材cDNA芯片構(gòu)建及毛狀根基因表達(dá)譜研究[D]. 崔光紅.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 2006

碩士論文
[1]南極海冰細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.GST的克隆及酶學(xué)特性研究[D]. 洪艷艷.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 2013
[2]溶藻弧菌毒力菌株基因缺失突變株的構(gòu)建及表型初步分析[D]. 李宏.海南大學(xué) 2013
[3]大腸桿菌cysE和cysM基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[D]. 方堃.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2011



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