大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV）引起的大口黑鱸彈狀病毒病是危害大口黑鱸養(yǎng)殖的主要病害之一。該病傳播速度快,致死率高,一旦發(fā)病,在一周內(nèi)可導致100%的養(yǎng)殖魚類死亡,造成的危害極大。目前,尚無任何針對該病的特效藥,因此對其抗病毒藥物研究尤為重要。本研究通過細胞模型評價19種化合物的抗病毒活性,篩選具有較高抗MSRV活性的化合物,以期為開發(fā)抗MSRV藥物提供理論基礎。主要獲得以下結果:1.19種化合物體外抗MSRV活性篩選利用MTT法測定19種化合物對草魚卵巢細胞（CO）的毒性,以最大安全濃度篩選具抗MSRV活性的化合物。通過Reed-Muench法測得MSRV在感染CO細胞96h后的TCID₅₀為10^-4.29/100μL。1000×TCID₅₀病毒液感染CO細胞后,利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測MSRV G基因表達,篩選出3種對MSRV增殖抑制率超過50%的化合物,即:鳥嘌呤核苷（A）、阿糖腺苷（E）和牛蒡子苷元（Q）。其中,鳥嘌呤核苷抗M... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

感染MSRV的大口黑鱸（Maetal.2014）

SO 溶液共八個濃度，向 CO 細胞大約生長至 70~80%的 96 孔培養(yǎng)板加入上述.1mL/孔，進行化合物對細胞毒性檢測。加樣時，每個藥物處理設置 8 個平行置正常細胞對照。在 96h 后，按照 MTT 法測細胞活性。期間觀察并記錄細胞。（MTT 比色法見附錄 F）.4 化合物抗 MSRV 活性篩選根據(jù)化合物對細胞毒性試驗的檢測結果，將 19 種化合物按照濃度分為 3 組，L 組、10mg/L 組和 50mg/L 組，每組化合物濃度作用下，細胞存活率均高于 9長至對數(shù)期、濃度大約為 1.8 × 104個/孔的 CO 細胞按照 0.5 mL/孔接種于 24養(yǎng)板，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞長成單層。吸出舊的細胞培養(yǎng)液，PBS 清洗 2~3 1000 TCID50由細胞維持液稀釋的 MSRV，28℃孵育 2 h，回收病毒液，PBS 次，再加入細胞維持液稀釋后的各濃度化合物 0.5mL/孔，設置 DMSO 對照組活率高于 90%），28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h 后收取細胞液（操作示意圖見圖 2-1）。 離心 5 min。棄上清，加入 TRIzol 試劑（每 0.2 mL 所得沉淀加入 1 mL TRIz總 RNA 提取見附錄 5.

圖 2-2 MSRV 的 PCR 鑒定Figure 2-2 PCR identification of MSRVM：DNAMarker DL2000 1：毒株D50測定結果胞的病變情況，在 96h 之后，對照組細胞生對照孔有明顯差異，且 CPE 現(xiàn)象基本不再發(fā)生 10-4與 10-5之間的稀釋度能使 50%的細胞出SRV 感染 CO 細胞 96h 的 TCID50=10-4.29/100μLCO 細胞 96 h 內(nèi)的病毒滴度曲線變化如圖 2-3著病毒感染細胞時間的增長，病毒滴度呈上表明，病毒對細胞的致病作用主要發(fā)生在 72

【參考文獻】：
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本文編號：2932407