螺原體隸屬于柔膜體綱,是一類無細胞壁、具有螺旋外形和運動能力、基因組精簡的細小微生物。中華絨螯蟹螺原體Spiroplasma eriocheiris已經被證實是導致中華絨螯蟹顫抖病的病原,是第一個在水生甲殼動物體內發(fā)現(xiàn)的螺原體類微生物,基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該病原與非凡螺原體Spiroplasma mirum有高達98%的相似度,S.mirum最初從兔虱蜱上分離得到,后被證實能感染脊椎動物剛出生幼體并誘發(fā)白內障,還能利用雞胚增殖并最終導致雞胚死亡。與S.mirum相似的是,S.eriocheiris也具有感染乳鼠并導致白內障病癥的能力(不能感染成年小鼠),感染雞胚時S.eriocheiris能通過雞胚卵黃囊傳播至體內各組織,隨后出現(xiàn)在雞胚腦部。雖然螺原體感染脊椎動物的組織病理學證據很明顯,但其感染機制方面的報道卻很少。基于課題組前期建立的S.eriocheiris感染小鼠胚胎成纖維細胞3T6的細胞感染模型,運用表達譜芯片和microRNA芯片技術篩選3T6細胞被S.eriocheiris感染前后mRNA和miRNA的差異表達,并用生物信息學方法及實驗手段對芯片結果進行聯(lián)合分析和功能驗證。另一方面,應用酵母雙雜交技術來篩選S.eriocheiris黏附蛋白ALP的互作蛋白,探討其在病原入侵宿主細胞過程中的作用,這些都將為闡述S.eriocheiris對宿主感染的分子機制奠定基礎。1.基于表達譜芯片技術研究S.eriocheiri 侵染3T6細胞的機制為深入研究螺原體侵染3T6細胞的分子機制,我們進行了表達譜芯片實驗,選取未感染和螺原體感染6 h后的3T6細胞,分兩組,每組3個平行,共6個實驗樣本,按表達譜芯片RNA質控標準,提取了細胞的總RNA,用Agilent小鼠GE 4×44K v2芯片(包含39430個探針)進行基因表達分析,按照表達譜芯片操作流程,對總RNA進行了 cDNA反轉錄、熒光標記、探針雜交及數據掃描等,采用MeV可視化軟件檢測差異表達探針確認顯著差異表達基因,實驗最終篩選出619個差異表達基因(183個上調,436個下調),隨后使用DAVID在線數據庫對顯著差異表達基因進行功能富集分析,并利用STING在線數據庫研究差異表達基因在蛋白質相互作用網絡中的分布情況,GO和KEGGpathway分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因集中在神經營養(yǎng)因子信號通路、阿爾茨海默病、胰島素信號通路、黏著斑、軸突導向等14條信號通路上。2.S.eriocheiris侵染3T6細胞過程中差異microRNA的篩選miRNA芯片實驗在杭州聯(lián)川生物公司完成,選用的是MRA-1002 miRmouse v20芯片,基于Sanger miRBase 20數據庫進行數據分析。每個芯片都包含多個控制探頭,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B是單基匹配檢測探頭。RNA樣本為表達譜芯片同批的6個細胞總RNA,雜交前6組樣品分別添加了 20個堿基的陽性對照序列,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B的強度比值大于20的列為差異條帶,用單因素方差分析計算P值,用Cluster 3.0和TreeView軟件來進行聚類和主成分分析(PCA)。miRNA芯片共檢測出1982個3T6細胞miRNA,相較于對照組,被感染組3T6細胞有22個差異顯著的miRNA(8個上調,14個下調),依據“種子”序列原則,我們用TargetScan、miRanda和PicTar三種軟件來預測差異miRNA的靶基因,綜合軟件分析結果,共獲得靶基因數量3781個。在這22個差異miRNA中,5個miRNA(2個上調,3個下調)信號強度小于500,以上結果說明螺原體侵染3T6細胞狀況下,宿主3T6細胞表現(xiàn)出一個獨特的miRNA表達模式。3.S.eriocheiris侵染3T6細胞RNA聯(lián)合分析及功能驗證結合上述表達譜芯片和miRNA芯片結果進行聯(lián)合分析,對比差異表達的miRNA靶基因和mRNA微陣列的差異表達基因,篩選出177個共同基因,并重點關注其中miRNA和mRNA變化負相關的共同基因進行KEGG通路分析,結果表明,相關基因大量集中于黏附和MAPK信號通路,說明這兩個通路是螺原體感染宿主細胞的重要途徑。為了驗證基因芯片的結果,從以上兩個通路中選取了 8個mRNA進行實時熒光定量PCR和Western blotting驗證實驗:黏附(β-Catenin、Parvin、Grb2 和 ERK);MAPK 信號通路(FGFR、Grb2、ERK、MKK3、p38和JNK),看家基因GAPDH作為對照。驗證實驗得到的變化趨勢是β-Catenin(上調)、Parvin(上調)、FGFR(下調),ERK(下調),MKK3(下調)、p38(下調)芯片和RT-PCR結果趨勢是一致的,Grb2在微陣列分析中結果是下調,但RT-PCR結果是沒有顯著變化,各基因免疫印跡結果與RT-PCR結果相吻合。同時也選取了 8 個 miRNA(mir-143-3p,mir-214-5p,mir-322-3p,mir-328-5p,mir-351-5p,mir-466h-5p,mir-503-5p 和 mir-30c-1-3p)進行 qPCR 驗證,管家基因U6 miRNA作為對照,其中5個來自MAPK信號通路的miRNA均顯示上調,其芯片和qPCR的結果得到了相互佐證。我們推測,當3T6細胞被螺原體感染后MAPK信號通路被抑制,細胞正常代謝遭到破壞,使得病原更易感染細胞。4.S.eriochei i 黏附蛋白ALP在侵染3T6細胞過程中的作用利用免疫膠體金及Western blotting技術來對S.eriocheiris黏附蛋白ALP進行定位,免疫電鏡觀察結果顯示ALP在螺原體的膜表面;將S.eriocheiris全蛋白、膜蛋白及胞質蛋白分別與ALP多抗血清孵育后進行免疫印跡實驗,結果顯示全蛋白及膜蛋白有印跡條帶而胞質蛋白則沒有,這與免疫電鏡結果相吻合。研究還發(fā)現(xiàn)ALP參與了螺原體侵染小鼠3T6細胞的過程,抗體中和實驗顯示螺原體經ALP多抗血清30 ℃孵育1 h后,再感染3T6細胞,36 h后進入3T6細胞的螺原體顯著少于對照組,其侵染能力明顯減弱,說明黏附蛋白ALP這一螺原體表面蛋白,在螺原體入侵宿主細胞過程中起著關鍵作用。5.S.eriochei i 黏附蛋白ALP互作蛋白的篩選及功能鑒定利用酵母雙雜交技術篩選了能與螺原體黏附蛋白ALP相互作用的小鼠蛋白,結果顯示ALP可以與小鼠中的137個基因片段互作,選擇其中的纖連蛋白7(Fibulin7)進行驗證,原核重組表達后利用Far-western blotting確認了 ALP與Fibulin7片段(含有兩個EGF結構域)的相互作用,激光共聚焦確認ALP與Fibulin7片段可以共定位。人工合成了 Fibulin7的另外兩個結構域(EGF結構域:136-172AA和補體控制蛋白CCP結構域:81-134AA),結果顯示僅Fibulin7的EGF結構域能與ALP結合,由于EGF結構域與EGF有高度同源性,而EGF是EGFR信號通路重要的上游信號分子,當ALP重組蛋白刺激3T6細胞后,ALP與EGF競爭性結合而使得EGFR通路被抑制。未出生的小鼠、新生乳鼠和乳鼠期接種螺原體后成年患白內障的小鼠體內都檢測出Fibulin7基因的表達,而正常成年小鼠則沒有,新生乳鼠大腦部位含有豐富的EGF,ALP通過與EGF的互作促成了 S.eriocheiris對乳鼠的感染。本實驗證實S.eriocheiri 外膜蛋白ALP在其侵染哺乳動物細胞中起關鍵作用。FBLN7蛋白的EGF結構域是ALP作用的識別位點,ALP通過與EGF結構域結合進而與宿主細胞相結合,ALP促進了病原菌與宿主細胞的黏附及后續(xù)的侵染過程。
【學位單位】：南京師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S945
【部分圖文】：

來進行細胞死亡的判斷。用碘化丙啶（ＰＩ）進行細胞染色，在熒光顯微鏡的激發(fā)下，??正常貼壁的細胞沒有出現(xiàn)任何顏色，漂浮著的細胞顯現(xiàn)出紅色，表明這些細胞已??經死亡（如圖２．１）。??Ｍ??圖２．１⑷正常３Ｔ６細胞；（Ｂ）中華絨螯蟹螺原體感染３Ｔ６細胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原體２４?ｈ后的３Ｔ６細胞，死亡細胞被染成紅色，而活細胞不能被染色（２〇ｘ）。標尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式細胞技術來分析誘導３Ｔ６細胞凋亡的情況，結果如圖??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６細胞４８?ｈ后能明顯的誘導細胞凋亡。樣品經??過Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ雙重染色標記后，定量分析結果如圖２．２Ｃ、Ｄ所示，與對照??組相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６細胞４８?ｈ后凋亡細胞的百分率顯著增加（ｐ??＜０．０５）。如圖２．２Ｅ所示，細胞活力也明顯低于對照組（無病原菌刺激）。??２７??

來進行細胞死亡的判斷。用碘化丙啶（ＰＩ）進行細胞染色，在熒光顯微鏡的激發(fā)下，??正常貼壁的細胞沒有出現(xiàn)任何顏色，漂浮著的細胞顯現(xiàn)出紅色，表明這些細胞已??經死亡（如圖２．１）。??Ｍ??圖２．１⑷正常３Ｔ６細胞；（Ｂ）中華絨螯蟹螺原體感染３Ｔ６細胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原體２４?ｈ后的３Ｔ６細胞，死亡細胞被染成紅色，而活細胞不能被染色（２〇ｘ）。標尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式細胞技術來分析誘導３Ｔ６細胞凋亡的情況，結果如圖??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６細胞４８?ｈ后能明顯的誘導細胞凋亡。樣品經??過Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ雙重染色標記后，定量分析結果如圖２．２Ｃ、Ｄ所示，與對照??組相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６細胞４８?ｈ后凋亡細胞的百分率顯著增加（ｐ??＜０．０５）。如圖２．２Ｅ所示，細胞活力也明顯低于對照組（無病原菌刺激）。??２７??

結合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｍｃｌｅ６ｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）２１％、核糖核苷酸結合（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）和喔??呤核糖核苷酸結合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）各?２０％、ＫＮＡ?結合（ＲＮＡ??ｂｉｎｄｉｎｇ）１０°／〇等共７個分類。具體分析情況見下圖（
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本文編號：2891825