傳染性造血器官壞死病(Infectious hematopoietic necrosis of fish,IHN)是由傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis Virus,IHNV)引起的一種急性的、全身性的魚類傳染病,以鮭、鱒等冷水魚類為主要感染對象,1985年在我國遼寧省本溪市暴發(fā)此病,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病時(shí)以魚體出血,腎臟和脾臟造血組織壞死為典型特征,IHN的感染造成成魚死亡率為10~25%,幼魚死亡率可達(dá)100%,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物疫病,為我國的二類疫病,是口岸魚類的第一類檢疫對象。因此研制免疫效果好,安全性高,成本低廉的新型疫苗成為研究的熱點(diǎn)。目前利用植物作為生物反應(yīng)器,開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)生物藥品受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。萊茵衣藻作為一種新型的植物表達(dá)系統(tǒng),不僅具有可準(zhǔn)確表達(dá)外源基因,生產(chǎn)環(huán)境安全性好等一般優(yōu)勢,同時(shí)還具有萊茵衣藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單,培養(yǎng)條件容易,繁殖速度快,可大批量生產(chǎn),同時(shí)還具有成本低廉,光合效率高等自身特點(diǎn),利用其作為生物反應(yīng)器研制魚類口服疫苗具有良好的應(yīng)用前景。并且藻類又是魚類的天然餌料,用萊茵衣藻研究IHNV病毒更具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。本研究將實(shí)驗(yàn)室保存的IHNV病毒在單層FHM細(xì)胞上擴(kuò)增,出現(xiàn)典型的CPE時(shí)收集細(xì)胞毒,提取細(xì)胞毒中FHM細(xì)胞和IHNV病毒總RNA,以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR,獲得G蛋白基因,將G蛋白基因克隆到pMD-18T載體上成功構(gòu)建pMD-18T-IHNV-G重組質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)TOP10感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增,提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后,進(jìn)行基因測序,測序結(jié)果顯示與已公開IHNV的HLJ-09株(登錄號:JX649101)同源性為99%。將pMD-18T-IHNV-G重組質(zhì)粒和pChlamy-4載體雙酶切后回收,用T4連接酶連接,構(gòu)成pCh-IHNV-G重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pCh-IHNV-G經(jīng)大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞的擴(kuò)增后,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證,再將重組質(zhì)粒線性化,并應(yīng)用電穿孔技術(shù)將其導(dǎo)入細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻中,利用博來霉素進(jìn)行抗性篩選,提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻DNA進(jìn)行PCR檢測,證明IHNV糖蛋白基因已經(jīng)隨機(jī)整合到萊茵衣藻核基因組中,提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻總蛋白,經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析得到一條大約為58KDa的蛋白條帶,與預(yù)期結(jié)果相符。Western blot分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻所表達(dá)的蛋白可以與6×HIS標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合,具有良好的反應(yīng)原性。將轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻、萊茵衣藻、PBS溶液分別飼喂給Balb/c小鼠,連續(xù)灌胃7天后進(jìn)行攻毒,并在飼養(yǎng)的第0、7、14、21、28天稱量小鼠體重,攻毒后7天,取小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群的變化。從體重變化上發(fā)現(xiàn)在灌服轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻期間小鼠體重與對照組相比下降,但在攻毒后小鼠體重增長明顯高于對照組和灌服萊茵衣藻組。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示灌胃轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞含量都有所增加,表明轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻能夠刺激小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增值,從而有助于提高機(jī)體的免疫應(yīng)答的作用。本研究表明,轉(zhuǎn)IHNV糖蛋白基因萊茵衣藻可刺激動(dòng)物體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增值,有助于提高機(jī)體的免疫功能。轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻具備研制口服疫苗的前提條件,為進(jìn)一步開發(fā)高效安全的口服魚類疫苗或具有提高免疫功能的藻類飼料打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S941.41
【部分圖文】：

將IHNV病毒加入FHM單層細(xì)胞中進(jìn)行病毒擴(kuò)增，置于16 ℃連續(xù)培養(yǎng)，第2天開始細(xì)胞出現(xiàn)收縮變圓等明顯的細(xì)胞病變，最后大部分細(xì)胞崩解、脫落。而未接毒的對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，待病變達(dá)到如圖2-1時(shí)可收集細(xì)胞毒。

Fig. 2-1 Virus on FHM monolayer cell lesions.RNA 的提取及 PCR 結(jié)果NA 的提取出現(xiàn)明顯病變，按照TRIZol試劑說明書操作提取細(xì)A如圖2-2。

M：DL-2000 Marker；1 和 2 均為 IHNV PCR 產(chǎn)物圖 2-3 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2-3 The result of PCR
【參考文獻(xiàn)】

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1 王光玉;曲徑;徐仲;陳雷;程剛;;傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV)的危害、檢疫及防治[J];中國動(dòng)物檢疫;2006年10期

本文編號：2880207