中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹、毛蟹和大閘蟹,是一種分布廣泛的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。中華絨螯蟹因其味道鮮美而馳名中外、備受青睞,其富含的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值也使它名正言順地成為我國(guó)的名特優(yōu)水產(chǎn)品。近年來(lái),由于中華絨螯蟹的市場(chǎng)需求量日益增長(zhǎng),價(jià)格也節(jié)節(jié)攀升,養(yǎng)殖戶們開始爭(zhēng)相擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模和提高集約化程度,但與此同時(shí)也給中華絨螯蟹的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。一系列問題如農(nóng)藥、抗生素的濫用、養(yǎng)殖環(huán)境惡化和宿主免疫疲勞等給中華絨螯蟹的養(yǎng)殖帶來(lái)了極大損失。為了推行健康養(yǎng)殖的理念,我們探究了飼料中添加不同水平的L-色氨酸及其代謝產(chǎn)物——褪黑激素對(duì)中華絨螯蟹的血糖代謝及免疫性能的影響,并結(jié)合對(duì)腸道內(nèi)菌群多樣性的研究,以期為中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。(1)投喂中華絨螯蟹4組不同L-色氨酸添加量的飼料(L-色氨酸占比分別為0.36%、0.47%、0.73%和1.05%,分別記為第1、2、3和4組)30天后,測(cè)定血糖代謝相關(guān)指標(biāo)、糖酵解反應(yīng)過程中主要限速酶在組織中的表達(dá)量及血清和肝胰腺抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示:飼料中添加不同含量的L-色氨酸對(duì)中華絨螯蟹血糖水平無(wú)顯著影響(P0.05),平均約為4.62 mmol/L。隨著飼料中L-色氨酸添加量的增加,肝胰腺糖原含量呈上升趨勢(shì),其中第4組蟹肝糖原含量顯著高于第1組(P0.05)。此外,在對(duì)中華絨螯蟹糖原磷酸化酶活性進(jìn)行測(cè)定分析時(shí)發(fā)現(xiàn)L-色氨酸對(duì)其影響并不顯著(P0.05)。采用熒光定量PCR分別探究了丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)和糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)在中華絨螯蟹十種不同組織(眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)、腸、肝胰腺、胃、心、血、肌肉和鰓)中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)均有表達(dá)但不同組織間的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P0.05)。PK mRNA在心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于其他組織(P0.05),而在眼柄中表達(dá)最低。GSK3 mRNA在胸神經(jīng)節(jié)中的相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于其他組織(P0.05),同樣的也是在眼柄中表達(dá)最低。此外,我們還分析了不同L-色氨酸飼料投喂后,中華絨螯蟹PK和GSK3 mRNA在4種不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):中華絨螯蟹心臟和腦神經(jīng)節(jié)中PK mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化(P0.05)。但在胸神經(jīng)節(jié)和肌肉組織中,隨著飼料中L-色氨酸添加量的增加,PK mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著上升(P0.05)。同樣地,各組蟹腦神經(jīng)節(jié)中GSK3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量也無(wú)顯著變化(P0.05),而隨著飼料中L-色氨酸含量的提高,胸神經(jīng)節(jié)、心臟和鰓組織中GSK3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組而言有顯著提高(P0.05)。不同L-色氨酸飼料投喂后,中華絨螯蟹血清T-AOC、T-SOD和ACP活力及肝胰腺T-AOC均未發(fā)生顯著變化(P0.05),但血清CAT和AKP活性卻隨著L-色氨酸添加量的增加而呈上升趨勢(shì)。其中,第4組中華絨螯蟹血清的CAT和AKP活性顯著高于第1組(P0.05)。攝食試驗(yàn)組飼料后中華絨螯蟹的肝胰腺T-SOD活性顯著高于對(duì)照組(P0.05)。此外,第3和4組中華絨螯蟹的肝胰腺CAT活性顯著高于第1和2組(P0.05),其中第1組蟹的CAT活性在數(shù)值上最低。(2)通過高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)4組L-色氨酸飼料投喂后的中華絨螯蟹的腸道內(nèi)微生物進(jìn)行了16S rRNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增,經(jīng)Illumina平臺(tái)測(cè)序發(fā)現(xiàn),飼料中添加L-色氨酸能夠顯著提高腸道菌群的豐富度和多樣性。中華絨螯蟹腸內(nèi)主要的優(yōu)勢(shì)菌為柔膜菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)及放線菌門(Actinobacteria)。飼料中添加L-色氨酸能夠顯著提高中華絨螯蟹腸道內(nèi)變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的豐度。這些菌群均為優(yōu)勢(shì)菌,對(duì)中華絨螯蟹的免疫力有一定的促進(jìn)作用。(3)探究褪黑激素(Melatonin,MT)對(duì)中華絨螯蟹血糖代謝和血清及肝胰腺抗氧化和免疫水平的影響。首先,研究眼柄對(duì)血糖調(diào)節(jié)的作用,通過切除中華絨螯蟹單側(cè)或雙側(cè)眼柄后發(fā)現(xiàn),眼柄切除尤其是雙側(cè)眼柄切除能夠顯著降低中華絨螯蟹的血糖水平(P0.05)。無(wú)論中華絨螯蟹眼柄切除與否,注射MT均能顯著誘導(dǎo)高血糖癥并呈劑量依賴性的方式增加。其中,注射10~-66 mole/只的MT較其他劑量(10~(-12),10~(-10),10~(-9),10~(-8)和10~(-7) mole/只)而言對(duì)血糖水平的影響更為明顯。RT-PCR反應(yīng)顯示中華絨螯蟹十種不同組織(眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)、腸、肝胰腺、胃、心、血、肌肉和鰓)中CHH mRNA的相對(duì)表達(dá)量存在組織特異性�；贑HH mRNA在上述組織中的相對(duì)表達(dá)量,選擇眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、腸和血淋巴這四個(gè)組織用于后續(xù)探究注射MT對(duì)中華絨螯蟹CHH mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示:較眼柄完整組而言,雙側(cè)眼柄切除導(dǎo)致中華絨螯蟹胸神經(jīng)節(jié)、腸和血淋巴組織中CHH mRNA的相對(duì)表達(dá)量得到顯著提升(P0.05)。和對(duì)照組相比,不論眼柄是否切除,注射MT均能顯著提高眼柄、胸神經(jīng)節(jié)和腸道組織中的CHH mRNA相對(duì)表達(dá)量(P0.05)。此外,MT的注射還導(dǎo)致中華絨螯蟹的肝胰腺及肌肉中總碳水化合物(TCHO)和糖原含量的顯著降低,而糖原磷酸化酶(a和b)活性卻明顯提高(P0.05)。切除中雙側(cè)眼柄對(duì)華絨螯蟹血清T-AOC、T-SOD和ACP活性沒有顯著影響(P0.05),但CAT和AKP活性較眼柄完整組而言則顯著降低(P0.05)。不僅如此,肝胰腺T-SOD和CAT活性也顯著降低(P0.05)。一方面對(duì)眼柄完整組而言,注射MT能夠顯著提高血清T-SOD、CAT、ACP和AKP活性(P0.05),對(duì)T-AOC未有明顯影響(P0.05)。另一方面,對(duì)雙側(cè)眼柄切除組而言,在注射MT2h后,中華絨螯蟹血清T-AOC、T-SOD、CAT、ACP和AKP活性顯著提高(P0.05),除此之外,肝胰腺T-SOD和CAT活性也顯著提高(P0.05)。但是,無(wú)論眼柄切除與否,注射MT均未對(duì)血清及肝胰腺T-AOC造成顯著差異。上述結(jié)果表明:飼料中L-色氨酸的添加量對(duì)血糖水平的影響并不明顯,但能顯著提高中華絨螯蟹的抗氧化及免疫能力。此外,飼料中添加L-色氨酸還能豐富中華絨螯蟹腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群,有助于機(jī)體防御病害。L-色氨酸的代謝產(chǎn)物——MT能夠誘導(dǎo)中華絨螯蟹的高血糖癥,且不一定受眼柄組織中的CHH所調(diào)控。此外,MT還能適當(dāng)?shù)靥岣咧腥A絨螯蟹機(jī)體的抗氧化能力。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

3-dioxygenase, TDO）和吲哚 2, 3-雙加氧酶（Indoleamine 2,enase, IDO）這兩種限速酶作用下進(jìn)行代謝，最后經(jīng)多級(jí)酶促反應(yīng)生成喹uinolinic acid, QA）等活性分子[6]。代謝途徑如圖 1-1 所示：

從圖 2-1 和 2-2 中可以看出，PK 和 GSK3 mRNA 在這十，但表達(dá)水平不盡相同。其中，PKmRNA 在心臟組織的表達(dá)量著高于其他組織（P<0.05）；在眼柄組織中表達(dá)最低。因此，在我們選擇表達(dá)量較高的前四個(gè)組織，分別為心臟、胸神經(jīng)節(jié)、腦，用于后續(xù)分析。此外，GSK3mRNA 在胸神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量最其他組織（P<0.05），同樣的也是在眼柄中表達(dá)最低。關(guān)于 GSK3出表達(dá)量較高的前四個(gè)組織（心臟、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和鰓）

圖 2-2 中華絨螯蟹 GSK3 mRNA 在不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況The relative expression content of E. sinensis GSK3 mRNAin different tissuS.E., n=8)上述方法分析了 4 種不同組織中 PK 和 GSK3 mRNA 在不同 L達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示：4 種飼料投喂下，中華絨螯蟹心臟
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2878735