褶紋冠蚌(Cristaria plicata)是我國重要的淡水育珠蚌之一,易受病原體感染而發(fā)生疾病,對育珠能力會產(chǎn)生較大的影響,因此,開展對貝類分子免疫的研究具有重要意義。本文采用了巢氏PCR方法和RACE PCR技術(shù)克隆得到了褶紋冠蚌的Sigma型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)基因的cDNA序列。CpGST1 cDNA序列全長為1610 bp,其中690 bp的開放閱讀框編碼230個氨基酸,5’端非編碼區(qū)320 bp,3’端非編碼區(qū)600 bp。預測編碼的蛋白分子量為25.8 kD,等電點為8.87,由SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)沒有信號肽。克隆得到的CpGST2 cDNA長為826 bp,其中642 bp的開放閱讀框編碼213個氨基酸,5’端非編碼區(qū)151 bp,3’端非編碼區(qū)33 bp。預測編碼的蛋白分子量為23.9kD,等電點為6.67,由SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)沒有信號肽。通過對CpGST1和CpGST2基因在褶紋冠蚌不同組織中的表達分析發(fā)現(xiàn),在血淋巴、肝胰腺、閉殼肌、外套膜、鰓組織中均有表達,但表達存在一定的差異。CpGST1和CpGST2都在血淋巴中的表達量最低,其次是閉殼肌和外套膜,而在肝胰臟中的表達量最高。經(jīng)嗜水氣單胞菌刺激后,兩個基因在血細胞和肝胰臟中的表達都表現(xiàn)出顯著或極其顯著差異。本文還將基因擴增產(chǎn)物和表達載體PET-32a經(jīng)HindIII、XhoI雙酶切之后,連接并成功構(gòu)建了PET-32a-CpGST2原核表達質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中,加IPTG至終濃度為1mmol/L,37℃誘導8 h,得到大量融和蛋白,用Ni2+親和層析鎳柱純化,并測得其純化蛋白的活性為46.965±0.082μmoL/min/mg。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4;Q78
【部分圖文】：

圖 1-2GST-μ 和 GST-ζ 的二聚體圖[15]Fig 1-2. Dimer of GST-μ and GST-ζ1.4 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的功能谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione S-transferases，GST) 是解毒作用的同工酶[16]，構(gòu)成了重要生理功能的二聚體胞質(zhì)同工酶家族，在抗毒機制的第 II 階段起作用，因此又稱為 II 解毒酶[17-18]。GST 還具有非硒依賴性谷胱甘肽過氧化酶的活性，能清除脂類自由基，將有毒的過氧化物轉(zhuǎn)變成低毒的醇類物質(zhì)，從而起到阻斷脂質(zhì)過氧化的作用[19]。此外，GST 還可以促使白三烯和前列腺素的轉(zhuǎn)化[20]。（1）解毒作用谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶的作用機理主要以解毒作用為主，它是促使還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的活性基團 巰基與毒素結(jié)合，生成親電子絡(luò)合物，將原有的疏水化合物轉(zhuǎn)變成親水化合物，并誘導產(chǎn)生同工酶，對外源毒素物

9圖 1-3 GST 對 15d-PGJ2信號的衰減[47-50]。圖中所示為 15d-PGJ2合成和活性可能被前列腺素影響的各種轉(zhuǎn)錄因子。Attenuation of 15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2 signaling by GST. Thisfigure showsis of 15d-PGJ2and the various transcription factors whose activity may be influencedthe prostaglandin[47-50].研究的目的和意義國淡水資源廣闊，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也很繁盛，由于貝類具有較高的經(jīng)濟價類養(yǎng)殖業(yè)在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有很大的比例，主要的貝類有褶紋冠蚌和池蝶蚌等，它們主要用來培育珍珠、食用、制藥和制作魚類和家禽是，由于水環(huán)境的污染和疾病易發(fā)等狀況，在養(yǎng)殖過程中蚌容易大量

15圖 2-1 圖 2-1 SMART 技術(shù)原理圖（引自 Clontech 技術(shù)手冊）。注：CDS 引物、SmartⅡ寡核苷酸、PCR 引物都有一段相同的序列。Fig. 2-1 Theory chart of SMART technology (from Clontech technical manual).Note：The CDS, SmartⅡ oligonucleotide and PCR primers contained a stretch of identicalsequence.2.4.3 感受態(tài)（DH5α）的制備（1）挑取 DH5 固體培養(yǎng)基上的單菌落，放在 1.5 ml 的不含抗性的液體養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃震蕩培養(yǎng) 12 h。（2）將搖渾濁的菌液倒入 50 ml 不含抗性的液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 震蕩培養(yǎng) 3 h，測得其 OD 值為 0.567。（3）將液體培養(yǎng)基分裝于 1.5 ml 的離心管中，每管 1 ml，冰上放置 1 h.
【參考文獻】

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本文編號：2878339