中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,屬于甲殼綱,是我國(guó)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖品種之一,廣泛分布于淡水地區(qū)。1958年,從牛松果腺的提取物中發(fā)現(xiàn)了褪黑激素(Melatonin,MT),又叫褪黑素。MT主要由動(dòng)物松果腺分泌的一種激素,被認(rèn)為是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖的主要影響因子。在進(jìn)化過程中MT被保存下來(lái),說明MT有其獨(dú)特之處。MT在甲殼綱動(dòng)物的血糖穩(wěn)態(tài)以及促進(jìn)蛻皮和附肢再生中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,甚至可以通過影響X器官-竇腺?gòu)?fù)合體中激素的釋放,從而影響卵巢發(fā)育和成熟,而MT大多是通過褪黑素受體(Melatonin receptors,MTR)實(shí)現(xiàn)其功能的。但是MT與MTR是如何實(shí)現(xiàn)這些變化的許多分子機(jī)制需要進(jìn)一步的明確。最近,有人發(fā)現(xiàn)在雄性河蟹性腺的發(fā)育的過程中MTR基因表達(dá)顯著下調(diào),說明MTR參與了河蟹性腺的發(fā)育,而MTR在雄性河蟹生殖細(xì)胞中的分布特征及在生殖方面的功能還不清楚。本論文通過制備其相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫定位,分析MTR在河蟹生殖細(xì)胞和頂體反應(yīng)過程中的分布特征以及MT和MTR對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響和可能存在的作用機(jī)制,為進(jìn)一步分析MT和MTR的作用及為頂體反應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)首先對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已有的河蟹精巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,確定了制備多克隆抗體的免疫原序列,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的免疫原的基因序列。將帶酶切位點(diǎn)的MTR的基因片段用Nde I和Xho I酶進(jìn)行酶切,同樣用這兩種酶對(duì)載體pET-21b進(jìn)行酶切,酶切后,利用連接酶將兩者進(jìn)行連接,獲得含有MTR基因片段的重組質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,得到可以大量表達(dá)河蟹MTR蛋白的工程菌株。原核表達(dá)的MTR重組蛋白以包涵體形式存在,該包涵體是由尿素溶解的,并利用載體上的組氨酸與鎳柱的親和特性來(lái)純化得到MTR免疫原蛋白,然后對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,根據(jù)間接ELISA法來(lái)檢測(cè)MTR抗血清的效價(jià)。利用免疫印記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得的MTR多克隆抗體能夠有效的與其抗原結(jié)合。應(yīng)用免疫熒光技術(shù),對(duì)河蟹的生殖細(xì)胞中的MTR進(jìn)行定位分析。利用伊紅染色觀察精子,將提取的河蟹的新鮮精子分成4組,(1)對(duì)照組,用DMSO處理;(2)用MT處理;(3)用MT和MTR抗血清;(4)用MT和陰性血清處理,并統(tǒng)計(jì)計(jì)算精子的頂體反應(yīng)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在精子發(fā)生過程中MTR一直存在,在河蟹的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中,MTR均勻的分布在其質(zhì)膜上,在精細(xì)胞及中期精細(xì)胞中,MTR在質(zhì)膜上的分布不均勻,但是在精子時(shí)期,MTR定位于精子的頂體管膜上,并且在頂體反應(yīng)過程中,MTR一直存在;在統(tǒng)計(jì)精子頂體反應(yīng)率中,DMSO組與MT處理組間、MT處理組與MT和MTR抗血清處理組間均有極顯著性差異;DMSO組與加入10μM的MT和陰性血清兩組間存在極顯著性差異,而MT處理組與MT和陰性血清處理組間沒有差異。這說明MTR對(duì)河蟹精子的頂體反應(yīng)有作用,并且MTR可能是通過與MT結(jié)合促進(jìn)精子的頂體反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

最終形成N-乙�；�-5-甲氧基色胺，即褪黑素[3]（圖1-1）。圖1-1 褪黑素化學(xué)結(jié)構(gòu)[3]Fig.1-1 Chemical structure of melatonin[3]1.1.2 褪黑素的作用MT在生物體內(nèi)發(fā)揮著各種各樣的生物效應(yīng)，作為廣譜抗氧化劑[4]，改善睡眠[5-7]，維持葡萄糖的穩(wěn)態(tài)[8]，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡及晝夜節(jié)律、視覺、腦血管、生殖、神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)免疫功能[9-11]。MT是一種比較著名的天然抗氧化劑，其抗氧化作用已經(jīng)在各種病理?xiàng)l件下有了很廣泛的研究，研究結(jié)果表明其作用主要與自由基有關(guān)[12-15]。研究證實(shí)了MT在抗氧化防御系統(tǒng)中，參與調(diào)控一些酶的活性，如谷胱甘肽過氧化物酶；或直接清除活性氧，如過氧基、一氧化氮等一些強(qiáng)氧化性的物質(zhì)[15]

圖 1-2 MTR 的信號(hào)通路[75]a)褪黑素受體 MT1 或 MT2 單體受體信號(hào)；MT1 和 MT2 偶聯(lián) Gαi、β 和 γ 蛋活性，使得 cAMP 水平下降。(b)MT1/MT2 異質(zhì)二聚體受體信號(hào)；MT1/MT調(diào)控磷脂酶 C 和二�；视屯罚鸺�(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度上升。AC：腺苷酸環(huán) C；DAG：二�；视停籌P3：肌醇三磷酸；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸；PLCFig. 1-2 The signal pathway of MTR[75]T1 or MT2 monomeric receptor signaling. Both MT1 and MT2 melatonin receptois toxin–sensitive Gαi, β, γ proteins, inhibiting adenylyl cyclase and reduceing the P. (b) MT1/MT2 heterodimer receptor signaling. MT1/MT2 melatonin receptorssis toxin-insensitive Gq, β, and γ proteins. Melatonin binding with MT1/2 receptorphospholipase C and DAG pathway and then up-regulates the concentration of Cnylyl cyclase; DAG: diacylglycerol; IP3: inositol triphosphate; PIP2: phospha- tidbisphosphate; PKC: protein kinase C; PLC: phospholipase C.黑素受體與生殖要通過與高親和力受體結(jié)合級(jí)聯(lián)下游信號(hào)通路發(fā)揮作用。哺乳動(dòng)物膜上的分布是不均勻，且不同的物種間分布也是不同的，即使是那種馬和驢，同一時(shí)期射精的精子中也定位于不同位置。MTR在不能可能是不同的，它的功能可能與受精過程有關(guān)，可能通過提高其

7圖 1-3 中華絨螯蟹精子發(fā)生過程[85]a、a’、a’’：精原細(xì)胞；b、b’ 、b’’：初級(jí)精母細(xì)胞；c、c’、c’’：減數(shù)第一次分裂；c’’：次級(jí)精母細(xì)胞；d、d’：精細(xì)胞；d’’：精子；Sg：精原細(xì)胞；PSc：初級(jí)精母細(xì)胞；SSc：次級(jí)精母細(xì)胞；St：精細(xì)胞；Sz：精子（標(biāo)尺 20 μm）Fig. 1-3 Spermatogenesis in E. sinensis.a, a', a": Spermatogonium; b, b', b": Primary spermatocytes; c, c':The occurrence of thefirst division of meiosis; c": Secondary spermatocyte; d, d': Spermatids; d": Spermatozoa.Sg: spermatogonium; PSc: primary spermatocytes; SSc: secondary spermatocyte; St: spermatids; Sz:spermatozoa (bar 20 μm）1.3.2 河蟹精子結(jié)構(gòu)河蟹的精子會(huì)相互聚合形成一團(tuán)，外被一些物質(zhì)包裹著，這含有很多精子的小團(tuán)就是精莢[86]。精子結(jié)構(gòu)（圖1-4）主要由細(xì)胞核、輻射臂和頂體三個(gè)部分構(gòu)成。其細(xì)胞核因形狀似“杯”而被稱為核杯；河蟹精子上存在放射狀突起，同時(shí)，它也是核杯外側(cè)的突
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