1981年在美國夏威夷地區(qū)的細角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris)中首次發(fā)現(xiàn)的傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是全球養(yǎng)殖對蝦疾病中的主要病原之一,IHHNV感染的野生和養(yǎng)殖對蝦同時也遍布世界各地,世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation For Animal Health,OIE)將IHHNV收錄為甲殼類重要疫病之一(OIE 2015)。IHHNV隸屬于細小病毒科,濃核癥病毒亞科,短濃核癥病毒屬。IHHNV感染宿主范圍較廣,可感染世界各地的野生對蝦和養(yǎng)殖對蝦,感染的對蝦可通過水平或垂直傳播的方式傳染群體以及下一代仔蝦,對細角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris)死亡率高達90%,同時可引起凡納濱對蝦(L.vannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)等生長緩慢,患上慢性矮小殘缺綜合癥(runt deformity syndrome,RDS),造成對蝦生長參差不齊。IHHNV是對蝦病毒中最小的病毒,病毒粒子大小僅20-22nm,無囊膜二十面體�；蚪M全長約4.1kb,其中包含3個閱讀框,分別為ORF1、ORF2、0RF3,分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS-1)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS-2)和核衣殼蛋白(CP)。目前Genebank中已收錄了部分地區(qū)的分離株,包括夏威夷分離株(AF21266)、厄瓜多爾分離株(AY362548)、加利福尼亞分離株(AF273215)、中國福建分離株(EF633688)、中國臺灣分離株(AY355306、AY355307、AY355307)和泰國分離株(AY362547)等。目前已發(fā)現(xiàn)IHHNV有兩種基因型,即感染型(type1和type2)和非感染型(type 3A和type3B),其中非感染型屬于IHHNV嵌入對蝦基因組的情況,該類型可使對蝦攜帶病毒但無致病性和致死性。針對不同的基因型,OIE推薦了5對引物(389F/R、392F/R、77012F/77353R、309F/R和MG831F/R)分別用于檢測不同基因型的IHHNV。目前我國對于IHHNV的研究還是不夠成熟,關(guān)于IHHNV研究的相關(guān)報道較少,起步比較晚。而國外起步較早,研究的相對完善。尤其對于目前階段IHHNV在國內(nèi)的對蝦養(yǎng)殖模式中的流行情況及危害程度僅局限于病毒攜帶率,而沒有IHHNV的感染力和致病性等缺乏相關(guān)數(shù)據(jù),其次也沒有病毒載量與體長關(guān)系的相關(guān)分析數(shù)據(jù)。本研究是通過人工感染凡納濱對蝦仔蝦和自然狀態(tài)下感染凡納濱對蝦的兩種感染方式,分析其致病力;通過普通PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)對凡納濱對蝦進行檢測,分析其病毒拷貝數(shù),分析病毒載量與體長相關(guān)性。從而了解國內(nèi)IHHNV感染流行情況。本研究的主要內(nèi)容包括:1.IHHNV人工感染凡納濱對蝦仔蝦IHHNV能夠感染多種對蝦,對幼蝦危害最為明顯,目前沒有更好的防治方法。該病毒可以使凡納濱仔蝦生長緩慢,導致生長規(guī)格參差不齊,產(chǎn)量嚴重下降,損失嚴重。本文模擬養(yǎng)殖廠的養(yǎng)殖模式進行人工感染凡納濱對蝦仔蝦,然后將感染型IHHNV對蝦病料梯度稀釋后,通過投喂的方式對健康仔蝦進行人工感染。觀察記錄仔蝦的死亡和體長變化。結(jié)果顯示:IHHNV對凡納濱對蝦仔蝦的感染率很高,在人工感染24天后開始出現(xiàn)明顯死亡,死亡率保持在20.28%-44.25%,40天之后死亡率處于穩(wěn)定狀態(tài),而不同病原之間沒有顯著性差異;在人工感染后16-44天之間使凡納濱仔蝦體長下調(diào)0.74-0.80cm。為IHHNV致病力的研究提供宏觀的參考。2.實時熒光定量PCR檢測人工感染凡納濱對蝦仔蝦實時熒光定量PCR方法因其檢測靈敏度高、精確性好、便捷等因素,在對蝦病毒檢測中應(yīng)用越來越廣泛。本文根據(jù)OIE推薦的引物、探針、體系、程序等進行人工感染凡納濱對蝦仔蝦的檢測。人工感染12d內(nèi),凡納濱對蝦仔蝦體內(nèi)病毒拷貝處于上升趨勢,攻毒后兩天各組之間IHHNV病毒體內(nèi)拷貝數(shù)在103左右,當?shù)?2天時IHHNV病毒濃度最高拷貝數(shù)達到最大7.91×104 copies/μg DNA,12d-14d拷貝數(shù)開始下降,14d之后各組的IHHNV病毒拷貝保持穩(wěn)定。3.IHHNV、EHP混合感染凡納濱對蝦的PCR檢測2013年,河北、天津等地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對蝦育苗期出現(xiàn)死苗、出苗率低的情況,生產(chǎn)上仔蝦個體大小差異較大,造成了嚴重損失。本文采用熒光定量PCR(Real-time PCR)方法對天津大港地區(qū)采集的108尾凡納濱對蝦仔蝦樣品進行單尾病原檢測。結(jié)果顯示:傳染性皮下及造血組織壞死病毒和蝦肝腸胞蟲均有檢出,IHHNV陽性檢出率100%。每微克對蝦組織DNA的病毒拷貝數(shù)在103~107之間,且個體較大的樣品(1.2~2.0cm)攜帶病毒拷貝數(shù)整體偏高;EHP陽性檢出率為49.1%,每微克對蝦組織DNA的拷貝數(shù)在103~105之間,且集中于個體較小樣品(0.7~1.1cm)。對IHHNV和EHP陽性凡納濱對蝦樣品進行生物學體長與病毒載量指數(shù)相關(guān)性分析顯示,IHHNV載量指數(shù)與對蝦生長速率呈正相關(guān)關(guān)系,蝦組織IHHNV平均載量達到8.51×104copies/μg DNA,為較高的感染水平;EHP的載量與對蝦生長速率呈負相關(guān)性關(guān)系,與較大個體陽性檢出率較低相對應(yīng),蝦組織EHP平均載量達到2.19×104copies/μg DNA,為較高的感染水平。由此,該批凡納濱對蝦仔蝦患病及損失為IHHNV和EHP的混合感染所致,本文數(shù)據(jù)為IHHNV和EHP病原混合感染流行情況及其對養(yǎng)殖育苗期仔蝦生長的影響提供科學依據(jù)。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S945.49
【部分圖文】：

2.3 結(jié)果2.3.1 病料病毒含量根據(jù)實時熒光定量 PCR 檢測結(jié)果可知：深圳病原和阿根廷病原中病毒含量最高組（A 組）的病毒含量分別為 6.63×105copies/μg DNA 和 9.17×105copies/μg DNA，最低分別為 2.87×104copies/μg DNA 和 1.94×104copies/μg DNA，各組之間不是呈準確的 10 倍梯度，存在一定的誤差。此為阿根廷病原的初始病毒含量要高于深圳病原。如表 2-3，圖 2-1。表 2-3 病料 IHHNV 病毒拷貝數(shù)（copies/μg DNA）Table 2-3. Number of diseased IHHNV virus （copy copies/μg DNA）A B C D E廣東阿根廷6.63E+059.17E+051.39E+051.03E+056.32E+046.32E+043.06E+042.87E+042.87E+041.94E+04

上海海洋大學碩士學位論文圖 2-3 阿根廷病原存活率變化Fig 2-3 Argentine change map pathogen survival00.20.40.60.811.20 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52阿根廷A阿根廷B阿根廷C阿根廷D阿根廷E陰性對照空白對照仔蝦存活率%/攻毒后養(yǎng)殖天數(shù)/天

圖 2-7 養(yǎng)殖后期出現(xiàn)生長不齊Fig 2-7 Late growth appeared to grow討論本章同過人工感染凡納濱仔蝦，分析感染后存活率和體長變化，同時進行阿根廷毒株與中國毒株的差異性分析，從宏觀分析了 IHHNV 及不同毒株對凡納濱仔蝦的致病力。傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）是對蝦最重要的病源之一，對我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，同時也影響我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。1992 年我國養(yǎng)殖對蝦出現(xiàn)由白斑綜合征病毒（WSSV）引起的爆發(fā)性流行病，給我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊。90 年代中后期，隨著凡納濱對蝦的引入，對蝦病原也呈現(xiàn)多樣性。本實驗是在對凡納濱仔蝦、陰性樣品親蝦、陽性樣品親蝦進行普通 PCR 檢測 WSSV、IHHNV、EHP、AHPND 四種病原都符合實驗條件的前提下進行實驗的，保證了實驗凡納濱仔蝦和陰性樣品都不帶病原，人工感染樣品只帶 IHHNV。在制備病料過程中都是在冰上操作，而且各組之間嚴格防止交叉污染。對制備好的病料進行實時熒光定量 PCR 檢測，結(jié)果顯示各濃度之間的梯度不是特別明顯，主要是在制備過程中存在誤差，其中 D 組和 E 組誤差比較大，梯度2.4
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本文編號：2870957