一氧化氮(Nitrc Oxide,NO)是一氧化氮合酶(Nitrc Oxide Synthase,NOS)在熱激蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)的協(xié)同作用下,分解L-精氨酸產生的一種第二信使分子。以往研究中,NO是海洋無脊椎動物幼蟲變態(tài)的一種負調節(jié)因子,同時也是免疫系統(tǒng)中重要的調節(jié)因子,其對厚殼貽貝變態(tài)和免疫中的影響尚未有報道。本文通過藥理學、分子生物學和免疫刺激三種方法探究NO在厚殼貽貝幼蟲變態(tài)發(fā)育和成體免疫中的作用。1.NO供體、NOS抑制劑對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響為探究NO在厚殼貽貝幼蟲變態(tài)中的作用,通過藥理學實驗探究了NOS抑制劑和NO供體在厚殼貽貝幼蟲變態(tài)發(fā)育調控作用。結果顯示,在24 h暴露和持續(xù)暴露實驗中,NOS抑制劑aminoguanidine hemisulfate、S-methylisothiourea sulfate、L-NG-nitro arginine、7-nitroindazole均對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)表現出誘導作用,其中aminoguanidine hemisulfate的誘導活性最高,在持續(xù)暴露實驗中,稚貝率達到49%;NO供體L-Arginine、S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine、sodium nitroprusside均對厚殼貽貝幼蟲的變態(tài)有不同程度的抑制作用。綜上,NO對厚殼貽貝幼蟲的變態(tài)起到抑制作用,本研究成果為厚殼貽貝變態(tài)發(fā)育調控機制的研究提供有效理論依據。2.厚殼貽貝一氧化氮合酶基因的時空表達為進一步了解一氧化氮信號通路在厚殼貽貝變態(tài)中的分子機制,利用RACE技術獲得了厚殼貽貝的NOS基因cDNA序列。其總長度為5091 bp,含有一個4497 bp的開放性閱讀框,編碼1497個氨基酸序列。根據轉錄組中的厚殼貽貝cDNA序列設計定量PCR引物,利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術測定了NOS基因在野生厚殼貽貝幼蟲不同發(fā)育階段(擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲、稚貝),以及厚殼貽貝成體組織(消化腺、性腺、足、閉殼肌、外套膜、鰓)中的表達水平,并利用NOS酶活力測定實驗在蛋白水平驗證在發(fā)育階段中NOS基因的表達情況。在不同發(fā)育階段中,NOS基因在殼頂幼蟲階段的表達量最高,眼點幼蟲、稚貝時期表達量依次降低;NOS酶活力在擔輪幼蟲階段酶活力最低,D形幼蟲、殼頂幼蟲階段活力最高,眼點幼蟲、稚貝階段活力下降,與NOS基因在發(fā)育階段的表達趨勢相符。推測NOS在厚殼貽貝殼頂幼蟲階段參與了貝殼形態(tài)結構發(fā)生轉變的過程以及某些器官的形成與發(fā)育,而其在眼點幼蟲、稚貝兩個變態(tài)的關鍵階段,NOS基因的表達和NOS酶活力都較之前有下降,表明NO對厚殼貽貝幼蟲的變態(tài)起到抑制作用,這與藥理學實驗結果相符。成體組織中,NOS基因在鰓部表達量最高,足、消化腺、雄性腺中次之,推測NOS基因在厚殼貽貝成體中參與了呼吸、濾食、消化等活動。HSP90基因在殼頂幼蟲表達量最高,在眼點幼蟲和稚貝中表達量依次降低。綜上,NO對厚殼貽貝幼蟲的變態(tài)起到抑制作用,本研究為進一步開展雙殼貝類NO信號通路的功能研究提供了一定的理論依據。3.燦爛弧菌對厚殼貽貝免疫指標和消化酶活性的影響為探究燦爛弧菌對厚殼貽貝免疫指標和消化酶活性的影響,用1×10~6 cell/ml、1×10~7 cell/ml、1×10~8 cell/ml三個濃度的燦爛弧菌刺激厚殼貽貝,探討弧菌刺激后厚殼貽貝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MAD)等免疫指標和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的變化情況。結果顯示,足、鰓、消化腺三個組織在弧菌刺激48 h后,只有消化腺的NOS活性較對照組有顯著性升高,且酶活性隨初始細菌濃度的升高而升高,故選用消化腺來測定燦爛弧菌刺激后72 h內的免疫指標和消化酶活性的變化。燦爛弧菌刺激后,48 h內NOS活性較對照組均顯著升高。NO含量較對照組均顯著升高,與NOS顯現相同變化趨勢。SOD活性在各濃度刺激下較對照組均顯著升高,而MAD含量在實驗組中含量顯著低于對照組。淀粉酶活性在實驗組中顯著低于對照組,總體呈現先下降,后升高的趨勢。蛋白酶活性在各實驗組中均呈現先升高后下降的趨勢。本研究表明燦爛弧菌能刺激厚殼貽貝免疫指標和蛋白酶活性的升高,但對蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚殼貽貝對燦爛弧菌的免疫應答機制,為進一步研究燦爛弧菌和厚殼貽貝相互作用機制以及厚殼貽貝免疫機制奠定了基礎。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一章 一氧化氮在海洋無脊椎動物附著和免疫中的作用
    1 一氧化氮對動物生長發(fā)育的影響的研究
        1.1 一氧化氮簡介
        1.2 一氧化氮信號通路
        1.3 一氧化氮在各組織中的生理調節(jié)功能
    2 海洋無脊椎動物幼蟲變態(tài)發(fā)育的分子機制
        2.1 多毛類幼蟲附著變態(tài)發(fā)育的分子機制
        2.2 藤壺幼蟲附著變態(tài)的分子機制
    3 一氧化氮基因對海洋無脊椎動物生長發(fā)育影響的研究
    4 NO在水生動物免疫中的研究
        4.1 NO在魚類中的免疫
        4.2 NO在蝦類中的免疫
        4.3 NO在軟體動物中的免疫
    5 本研究展望
第二章 NOS抑制劑、NO供體對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)發(fā)育的影響
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 化學物質母液配制
        1.3 幼蟲變態(tài)實驗
        1.4 數據處理
    2 結果
        2.1 NOS抑制劑對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響
        2.2 NO供體對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響
    3 討論
第三章 厚殼貽貝NOS基因的時空表達
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 總RNA的提取
        1.3 一氧化氮合酶基因克隆
        1.4 序列分析
        1.5 熒光定量RT-PCR
        1.6 蛋白定量
        1.7 NOS活性測定
        1.8 數據處理
    2 結果
        2.1 一氧化氮合酶基因全長cDNA序列特征和系統(tǒng)進化分析
        2.2 厚殼貽貝NOS基因、HSP90基因的表達分析
        2.3 一氧化氮合酶活力的測定
    3 討論
第四章 燦爛弧菌對厚殼貽貝免疫指標和消化酶活性的影響
    1 材料和方法
        1.1 實驗菌株
        1.2 實驗材料
        1.3 總蛋白的提取
        1.4 免疫指標及消化酶活性的測定
        1.5 數據分析
    2 結果
        2.1 足、鰓、消化腺NOS酶活性比較
        2.2 免疫相關指標的變化
        2.3 消化酶的比較
    3 討論
小結
參考文獻
附錄
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 許玉潔;單洪偉;馬甡;;芽孢桿菌和溶藻弧菌對凡納濱對蝦消化酶、免疫酶活力及抗病力的影響[J];中國海洋大學學報(自然科學版);2015年05期

2 楊金龍;陳芋如;郭行磐;李一峰;徐燦;李家樂;;膽堿受體化合物對厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的調控作用[J];水產學報;2014年12期

3 �？姑�;吳劍鋒;;厚殼貽貝人工繁殖技術的研究[J];南方水產;2007年03期

4 劉波;劉文斌;王恬;;地衣芽孢桿菌對異育銀鯽消化機能和生長的影響[J];南京農業(yè)大學學報;2005年04期

5 王廣軍,謝駿,余德光;副溶血弧菌對九孔鮑血清中一氧化氮及一氧化氮合酶活力的影響[J];上海水產大學學報;2005年03期

6 王印庚,榮小軍,張春云,孫素鳳;養(yǎng)殖海參主要疾病及防治技術[J];海洋科學;2005年03期

7 姜國建,于仁誠,王云峰,顏天,周名江;中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細胞中一氧化氮合成酶的鑒定及其在白斑綜合癥病毒感染過程中的變化[J];海洋與湖沼;2004年04期

8 莫照蘭,茅云翔,陳師勇,張振冬,徐永立,張培軍;養(yǎng)殖牙鲆魚苗腹水癥病原菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析[J];海洋與湖沼;2003年02期

9 張濤;海洋無脊椎動物幼蟲附著變態(tài)研究進展�、�.影響因子[J];海洋科學;2000年01期

10 陳晉文，孫長凱，黃遠桂;一氧化氮合酶的若干研究進展[J];生物化學與生物物理進展;1996年04期

本文編號：2870513