對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的宿主范圍廣泛,能感染絕大多數(shù)的蝦蟹類,是蝦蟹類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要病原,傳染力強(qiáng),致死率高,給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于對(duì)WSSV的致病機(jī)理知之甚少,至今為止仍未找到一個(gè)行之有效的方法根治WSSV。在課題組的前期研究中,從WSSV感染的紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)造血組織(Haematopoietic tissue,Hpt)細(xì)胞差異基因表達(dá)譜中篩選到了兩種抗脂多糖因子(Anti-lipopolysacride Factor,ALF),一種為誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的 CqALF,另一種為表達(dá)量無顯著變化的CqALF2。本論文利用紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)、熒光定量PCR、電鏡觀察和重組蛋白真核表達(dá)等技術(shù)初步探究了CqAL 的抗病毒機(jī)理。取得成果如下:(1)克隆獲得了紅螯螯蝦CqALF基因cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào):KX083340)和CqALF 的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)序列。CqALF基因cDNA全長(zhǎng)序列包括ORF 372 bp,5'非編碼區(qū)108 bp,3'非編碼區(qū)383 bp。其ORF編碼123個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為13.35 kDa。CqALF2的ORF為372 bp,編碼123個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白大小約為13.86 kDa。螯蝦兩種ALF均具有兩個(gè)半胱氨酸連接的保守的LPS結(jié)合位點(diǎn)(LPS Binding Domain,LBD),預(yù)測(cè)的信號(hào)肽位置為前25個(gè)氨基酸。(2)闡明了 CqALF基因在健康螯蝦各組織器官的分布情況,結(jié)果顯示CqALF分布于檢測(cè)的所有組織器官中,在胃、上皮和眼柄中表達(dá)量最高。(3)為鑒定CqALF的生物學(xué)活性,優(yōu)化真核表達(dá)和純化工藝獲得CqALF重組蛋白 rCqALF。利用最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)法檢測(cè) rCqALF對(duì)所測(cè)試20種菌的抗菌活性。rCqALF對(duì)熒光假單胞菌等四種革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌等四種革蘭氏陽(yáng)性菌具有明顯的抑殺活性,其中對(duì)弗氏志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的殺菌活性較高,弗氏志賀氏菌的MBC小于6μM,而金黃色葡萄球菌則小于12μM。(4)rCqALF可以與WSSV囊膜蛋白互作,破壞病毒囊膜結(jié)構(gòu),繼而降低WSSV對(duì)宿主的感染率。電鏡觀察下rCqALF顯著破壞病毒囊膜結(jié)構(gòu),熒光定量檢測(cè)結(jié)果顯示rCqALF使得WSSV對(duì)體外Hpt細(xì)胞的感染率顯著下調(diào),并且rCqALF提高了螯蝦活體抵御WSSV感染的保護(hù)力。本研究揭示了CqALF在螯蝦免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,不僅具有廣譜抗菌活性,并且可以直接破壞WSSV囊膜蛋白達(dá)到抗病毒效果,為甲殼動(dòng)物抗WSSV新藥的研發(fā)提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

ＷＳＳＶ是一類具囊膜，無包涵體包被，有尾巴的桿狀雙鏈ＤＮＡ病毒。在電??鏡觀察下，橫切面為圓形，縱切面呈橢圓形，長(zhǎng)度約３００?ｎｍ，寬度約１００?ｎｍ。??其形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖１－２所示。完整的病毒粒子由三部分構(gòu)成，從外到里分別是病毒??囊膜（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、被膜層（Ｔｅｇｕｍｅｎｔ）和核衣殼（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）。??Ｗｆ?％?Ｈ｜?＾■纖＝一ｎｓ：??■?■國(guó)一—揭＝，ＶＰ５１Ｃ，??ＶＰ９５？ＶＰ３９Ａ＊??ｖｐ２６，?？?：?￥?—Ｅｎｖｅｌｏｐｅ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ：??漏＿?奶，??ａ?ｂｅ??圖１－１?ＷＳＳＶ的形態(tài)結(jié)構(gòu)ｆ２１??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＷＳＳＶ??ａ：完整的病毒例子；ｂ：核衣殼結(jié)構(gòu)；ｃ：病毒粒子三部分的結(jié)構(gòu)示意圖。??１??

導(dǎo)吞噬、包囊作用和形成結(jié)節(jié)等產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。體液免疫則是通過合??成抗菌肽、激活酚氧化酶系統(tǒng)和產(chǎn)生凝集素等體液相關(guān)免疫效應(yīng)分子發(fā)揮防御功??能［１８］（見圖１－２）。對(duì)于甲殼動(dòng)物而言，細(xì)胞免疫和體液免疫均是免疫系統(tǒng)必不??可少的，兩者相輔相成，因?yàn)閰⑴c體液免疫的免疫效應(yīng)分子必須從血細(xì)胞中合成??并釋放出來發(fā)揮功能。??ｆ?＾?：?．ｉＸｙ?＇－?．?，ｕ?ｎ?，?，Ｉ—ＸＵｆ?５」關(guān)＿？１？１＿１１＿＊＊＿？�。�??ＰＨＡＧＯＣＹＴＯＳＩＳ?ＮＯＤＵＬＥ?ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ??ｙ?夢(mèng)、ｙ?（?ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ?；??零職??Ｄｉｓｅａｓｅ－??ｃａｕｓｉｎｇ?ａｇｅｎｔｓ?乂?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｂｙ?Ｔｏｉｌ??ｈｒｐａｒｈ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ｐａｔｔｅｒｎ??ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｅｔｃ．??ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ??Ａｔ?ＪＬ??Ｗ??Ｈｕｍｏｒａｌ?Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ?Ｐｒｏ－?Ｌｅｃｔｉｎｓ?ａｎｄ??ｐｅｐｔｉｄｅ?（ＡＭＰ）?ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－??ｅｖｅｎｔｓ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｃａｓｃａｄｅ?ｌｉｋｅ?ｆａｃｔｏｒｓ??圖１－２無脊椎動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)１１８１??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｉｎｎａｔｅ?ｉｍｍｕｎｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ??１．２．２細(xì)胞免疫??甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞主要有三類，透明細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)沒有或者極少微小顆粒，??屬于嗜堿性細(xì)胞），半顆粒細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)有小顆粒，既嗜酸性或嗜堿性）和顆粒??細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)有大型顆粒

運(yùn)用ＲＡＣＥ技術(shù)擴(kuò)增Ｃ＃ｉＦ的５’和３’端序列，應(yīng)用ＤＮＡｍａｎ軟件拼接??得到?Ｃ如ＺＦ?基因?ｃＤＮＡ?全長(zhǎng)（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)?ＫＸ０８３３４０）。的?ｃＤＮＡ??全長(zhǎng)序列和氨基酸序列如圖２－２所示，ＣｇＡＬＦ的ｃＤＮＡ全長(zhǎng)８６３ｂｐ，通過ＥｘＰＡＳｙ??在線網(wǎng)站分析其ＯＲＦ框?yàn)椋常罚?ｂｐ，預(yù)測(cè)尸的蛋白長(zhǎng)度為１２３個(gè)氨基酸，分??子量大約為１３．３５?１＾＆，等電點(diǎn)則為９．５〖。非翻譯區(qū)５’１；�。保庇校暴枺福Γ�，３’１；丁尺則??有３８３?ｂｐ并具有典型的Ｐｏｌｙ?（Ａ）尾巴。Ｃ＋４ｉ：Ｆ２和有著相同的ＯＲＦ序??列長(zhǎng)度（圖２－３），分子量為１３．８６ｋＤａ，等電點(diǎn)為９．１２。??１９??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2865842