Ⅰ型干擾素(IFN)是由病原感染細(xì)胞后分泌的多肽,具有抗病毒、抗細(xì)菌和抗腫瘤的活性,同時(shí)還能促進(jìn)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。因此,了解發(fā)病中華鱘(Acipenser sinensis)中高表達(dá)的IFNes的功能有利于加強(qiáng)中華鱘的保護(hù),并且有助于加深對(duì)免疫進(jìn)化機(jī)理的認(rèn)識(shí)。在本研究中我們通過(guò)體外重組中華鱘IFNe2蛋白,并對(duì)其功能進(jìn)行了初步的研究。本試驗(yàn)將去除信號(hào)肽的中華鱘IFNe2編碼區(qū)序列克隆進(jìn)入pET-32a原核表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)中華鱘IFNe2在大腸桿菌中主要以可溶性蛋白的形式表達(dá),通過(guò)鎳親和層析可以得到較純的重組IFNe2蛋白。為了后續(xù)更好地對(duì)IFNe2的功能進(jìn)行研究,我們將位于中華鱘干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)3及IRF7 DBD(DNA-binding domain)結(jié)構(gòu)域與IAD(IRF association domain)結(jié)構(gòu)域之間的序列克隆到pET-32a載體中,發(fā)現(xiàn)IRF3和IRF7也都能以可溶性蛋白的形式表達(dá),并且可以得到較純的蛋白用于多克隆抗體制備。在4次免疫小鼠之后,獲得了較高效價(jià)的IRF3和IRF7多克隆抗體,其中IRF3抗體滴度超過(guò)1:729000,IRF7抗體滴度超過(guò)1:81000,此外,通過(guò)Western Blot檢測(cè)IRF3和IRF7多克隆抗體的特異性發(fā)現(xiàn)兩個(gè)多克隆抗體都具備較強(qiáng)的特異性。在中華鱘中,過(guò)去的報(bào)道已經(jīng)研究了IFNe2時(shí)空表達(dá)規(guī)律,但其生物學(xué)功能尚不清晰。本試驗(yàn)檢測(cè)了IFNe2的抗病毒作用,并且研究了IFNe2對(duì)IFN信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示,添加終濃度為1μg/mL重組中華鱘IFNe2蛋白能夠誘導(dǎo)EPC(epithelioma papulosum cyprini)細(xì)胞中Mx、PKR和Viperin的表達(dá)而激活EPC細(xì)胞的抗病毒活性,并且可以降低EPC細(xì)胞中SVCV(spring viraemia of carp virus)病毒G蛋白、N蛋白和P蛋白的表達(dá),減少病變效應(yīng)的產(chǎn)生,這一結(jié)果說(shuō)明中華鱘IFNe2具備抗病毒活性。重組中華鱘IFNe2蛋白還能影響IFN信號(hào)通路上基因的表達(dá)。通過(guò)在中華鱘鰭細(xì)胞系中加入1μg/mL的重組IFNe2蛋白可以誘導(dǎo)Mx、PKR、Viperin和ADAR4等干擾素刺激基因的表達(dá),尤其是極顯著地上調(diào)了Mx和Viperin的表達(dá),但是重組IFNe2不能誘導(dǎo)ADAR1-1和ADAR1-2的表達(dá),此外,重組IFNe2可以誘導(dǎo)IRFs的表達(dá),在誘導(dǎo)后3 h和6 h時(shí)顯著上調(diào)IRF1和IRF2的表達(dá),并持續(xù)上調(diào)IRF3和IRF7的表達(dá)至24 h,且誘導(dǎo)IRF7發(fā)生磷酸化。在加入1μg/mL的重組IFNe2蛋白刺激中華鱘鰭細(xì)胞系后,細(xì)胞中IFNe1和IFNe3的表達(dá)都在3 h時(shí)出現(xiàn)顯著上調(diào),并且隨后就恢復(fù)到正常水平,同時(shí)IFNe2還能誘導(dǎo)其自身的表達(dá),在6 h時(shí)先出現(xiàn)下調(diào),隨后在12 h時(shí)出現(xiàn)極其顯著的上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明IFNe2可能通過(guò)誘導(dǎo)IRF7發(fā)生磷酸化而擴(kuò)大IFN的免疫應(yīng)答。IRF是病毒和細(xì)菌誘導(dǎo)IFN信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄介質(zhì),在多種細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用,例如抵抗病毒入侵,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等。IRF對(duì)IFN的轉(zhuǎn)錄起著至關(guān)重要的作用,為了了解中華鱘IRF對(duì)IFNe2轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,本文以長(zhǎng)江鱘(Acipenser dabryanus)為研究對(duì)象研究了IRF1、IRF3、IRF4、IRF5和IRF8的結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式。除了IRF1外,所有IRF由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。此外,在預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列中,DBD結(jié)構(gòu)域與斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteus oculatus)具有最高的一致性。關(guān)于表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)五種IRF基因在所有檢測(cè)的組織中組成型表達(dá),并且在血液,腎,腸和脾中具有更高的表達(dá)。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,IRF1和IRF3的表達(dá)在脾臟和中腎中上調(diào),而IRF5和IRF8基因在中腎中均下調(diào)。此外,感染3 h后IRF4在脾和中腎中被嗜水氣單胞菌顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明長(zhǎng)江鱘IRF1、IRF3和IRF4可能對(duì)依賴于細(xì)菌誘導(dǎo)的IFN的轉(zhuǎn)錄起著重要的作用。
【學(xué)位單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 魚(yú)類(lèi) I 型 IFN 誘導(dǎo)途徑的假設(shè)模型[38]Fig 1-1 Hypothetical model of fish type I IFN induction pathway含 175-185 個(gè)氨基酸殘基，其中前 22-23 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，不同魚(yú)類(lèi)的 I 型干擾素的信號(hào)肽肽段之間相似性很高[5]。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)、氨基酸序列比對(duì)以及保守的半胱氨酸（C）模式等分析，硬骨魚(yú)類(lèi) I 型干擾素又被分為 group I（包括 IFN-a, -e, -d,-h）和 group II（包括 IFN-b, -c, -f）兩類(lèi)[23-27]。IFNa，IFNd 在絕大多數(shù)研究的硬骨魚(yú)類(lèi)中均已發(fā)現(xiàn)[28, 29]。IFNh 在鱸形目的大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）、鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi）、大西洋白姑魚(yú)（Argyrosomus regius）中均有報(bào)道[24-26]。IFNe研究報(bào)道最少，僅在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）以及中華鱘（Acipenser sinensis）中進(jìn)行了初步的研究[4,23,27,30]。作為group II的IFNb，IFNc 已經(jīng)在鯉形目[31]、鮭形目[32]、鲇形目[33, 34]、鱸形目[24-26, 35]、鰻鱺目[27]等魚(yú)類(lèi)中陸續(xù)被報(bào)道；此外，IFNf 也被發(fā)現(xiàn)于鮭形目[4]。1.2.2 I 型干擾素的進(jìn)化與分化從進(jìn)化的角度看，I 型干擾素存在于多種脊椎動(dòng)物中，包括魚(yú)類(lèi)[36-38]，兩棲類(lèi)[22]，

第 1 章 緒論類(lèi)同時(shí)具有兩個(gè)半胱氨酸（C1 和 C3）和四個(gè)半胱氨酸（C1、C2、C3 和 C4）的 I 型干擾素，而高等脊椎動(dòng)物 I 型干擾素均含有四個(gè)半胱氨酸（哺乳類(lèi) IFN-β、-ε除外）[5]。因此，他們提出一個(gè)假說(shuō)：魚(yú)類(lèi)擁有最多外顯子的 I 型干擾素，而在兩棲類(lèi)開(kāi)始出現(xiàn)無(wú)內(nèi)含子的 I 型干擾素；在爬行類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)出現(xiàn)的過(guò)程中，由于基因組逆轉(zhuǎn)座作用導(dǎo)致羊膜動(dòng)物 I 型干擾素丟失了內(nèi)含子；兩棲類(lèi)無(wú)內(nèi)含子的 I 型 IFN 是現(xiàn)代羊膜動(dòng)物無(wú)內(nèi)含子的 I 型 IFN 的祖先，非洲爪蟾無(wú)內(nèi)含子的 I 型IFN 可能僅僅代表爪蟾中或者兩棲類(lèi)中的一個(gè)獨(dú)立的分叉，羊膜動(dòng)物無(wú)內(nèi)含子的 I型 IFN 可能發(fā)生在爬行動(dòng)物從兩棲類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中的逆轉(zhuǎn)座現(xiàn)象[5, 22, 28]。

第 1 章 緒論發(fā)現(xiàn)了 IFN1 的兩個(gè)剪切異構(gòu)體，這兩個(gè) IFN1 異構(gòu)體缺乏信號(hào)肽，稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)的IFN（iIFN1），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)缺乏信號(hào)肽的 IFNR 異構(gòu)體（iIFNR1 和 iIFNR2）。當(dāng) iIFN1 與 iIFNR1 和 iIFNR2 結(jié)合時(shí)，能誘導(dǎo) STAT1 和 STAT2 發(fā)生磷酸化，并且最終誘導(dǎo)干擾素刺激基因的產(chǎn)生[72]。
【相似文獻(xiàn)】

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1 李由申;中華鱘Ⅰ型干擾素IFNe2的生物學(xué)功能研究[D];長(zhǎng)江大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2861882