羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)又稱馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦,是世界上個體最大的淡水蝦之一,同時也是目前國內(nèi)主要的三大淡水經(jīng)濟(jì)蝦類之一。自1976年引入中國以來,該品種在國內(nèi)的養(yǎng)殖面積逐年擴(kuò)大、產(chǎn)量逐年增加。然而,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及集約化程度的提高,一些由細(xì)菌、病毒等引起的病害日趨嚴(yán)重,其中還包括新型病原——中華絨螯蟹螺原體。前期研究表明,中華絨螯蟹螺原體通過鰓或體表進(jìn)入河蟹體內(nèi),侵染其靶細(xì)胞——小顆粒血細(xì)胞,在血細(xì)胞中大量繁殖,然后通過血細(xì)胞的流通將病原帶到機(jī)體各器官的結(jié)締組織中,并侵染到神經(jīng)和肌肉組織,造成病蟹感染前期的無力不食和感染后期的附肢顫抖等病癥。但作為一種沒有細(xì)胞壁的特殊細(xì)菌病原是如何黏附、侵染宿主靶細(xì)胞?在病原與宿主博弈過程中有哪些關(guān)鍵的蛋白相互作用?本博士學(xué)位論文在前期研究的基礎(chǔ)上,首先通過相對和絕對定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù),篩選螺原體感染7天后羅氏沼蝦血細(xì)胞中的差異蛋白,通過蛋白質(zhì)組學(xué)來分析螺原體可能的感染機(jī)制以及宿主的防御機(jī)理。其次,利用Far-western印記技術(shù)篩選羅氏沼蝦血細(xì)胞的候選受體蛋白,體外細(xì)菌結(jié)合及激光共聚焦實驗對所得到的受體蛋白進(jìn)行驗證,通過合成特異性雙鏈RNA,在羅氏沼蝦個體水平研究受體基因功能。最后,利用Far-western印記技術(shù)篩選對應(yīng)螺原體的配體蛋白,體外培養(yǎng)羅氏沼蝦血細(xì)胞,在細(xì)胞水平通過競爭性實驗對配體蛋白功能進(jìn)行研究。本論文為螺原體侵染機(jī)理及宿主免疫防御機(jī)制的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ),本文研究結(jié)果主要包括以下6個方面：1. iTRAQ篩選螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞的差異蛋白本實驗通過iTRAQ的研究,動態(tài)、整體、定量地觀察螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。篩選羅氏沼蝦血細(xì)胞經(jīng)過螺原體感染后的差異蛋白譜,初步鑒定出具有明確功能的蛋白與結(jié)合、催化、結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)等分子功能有關(guān)。本實驗選擇差異倍數(shù)大于等于1.5的蛋白進(jìn)行功能分析,實驗中篩選出69個具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異顯著蛋白質(zhì)。上調(diào)蛋白中,包括6個免疫相關(guān)蛋白,14個生理性蛋白,25個胞內(nèi)蛋白,4個未知／假設(shè)蛋白。下調(diào)蛋白中,包括4個免疫相關(guān)蛋白,3個骨架蛋白,11個生理性蛋白,2個未知／假設(shè)蛋白。選擇其中7個蛋白,通過qRT-PCR檢測對應(yīng)mRNA水平的表達(dá)變化,結(jié)果表明基本與iTRAQ篩選結(jié)果保持一致。2. Far-western印跡篩選羅氏沼蝦受體蛋白羅氏沼蝦血細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,以甲醛固定過的螺原體為覆蓋蛋白,然后依次孵育抗螺原體的兔多抗和抗兔的熒光標(biāo)記二抗。綜合Far-western結(jié)果,本實驗初步從羅氏沼蝦血細(xì)胞總蛋白中釣取了6種可能與S. eriocheiris相互作用的受體蛋白。根據(jù)分子功能,將受體蛋白分為三大類：細(xì)胞骨架、先天性免疫系統(tǒng)、信號傳導(dǎo)因子。細(xì)胞骨架,包括Beta-Actin、 Beta-Tubulin及Alpha-Tubulin蛋白。先天性免疫系統(tǒng),包括LGBP和proPO蛋白。信號傳導(dǎo)因子,包括Ran蛋白。3. Beta-Actin蛋白原核表達(dá)及受體功能驗證在此部分實驗中,以Beta-Actin為研究對象通過細(xì)菌結(jié)合及激光共聚焦實驗來驗證其作為受體蛋白的可靠性。體外細(xì)菌結(jié)合實驗,將純化的Beta-Actin重組蛋白與螺原體室溫結(jié)合2 h,然后PBS多次洗脫,最后用8M脲強(qiáng)力洗脫,結(jié)果Beta-Actin依然可以結(jié)合在螺原體的表面。激光共聚焦結(jié)果顯示綠色熒光標(biāo)記的螺原體貼附在紅色熒光的Actin蛋白上,兩者相互疊加產(chǎn)生黃色熒光,進(jìn)-步從細(xì)胞水平證實Beta-Actin與螺原體存在相互作用。4. LGBP蛋白原核表達(dá)及受體功能研究LGBP通常都能夠識別并結(jié)合脂多糖及β-1,3-葡聚糖,從而參與革蘭氏陰性菌和真菌的識別及防御,但是LGBP對于缺乏細(xì)胞壁細(xì)菌的識別還尚未有過報道。本研究首先重組表達(dá)并純化LGBP蛋白,體外細(xì)菌結(jié)合實驗證實LGBP蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。激光共聚焦實驗,采用抗LGBP鼠多抗和Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠二抗來特異性的標(biāo)記羅氏沼蝦血細(xì)胞的LGBP蛋白,結(jié)果顯示綠色熒光標(biāo)記的螺原體貼附在紅色熒光的LGBP蛋白上。接下來,合成LGBP特異性雙鏈RNA,觀察LGBP基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明,螺原體感染后第3天,LGBP dsRNA注射組的羅氏沼蝦血細(xì)胞中螺原體拷貝數(shù)明顯少于GFP dsRNA和PBS注射組。羅氏沼蝦存活率統(tǒng)計顯示,LGBP基因的沉默增加了宿主對螺原體侵染的敏感性,死亡率要高于兩個對照組。以上結(jié)果表明,LGBP作為胞外受體蛋白參與了螺原體黏附細(xì)胞的過程,但是除了LGBP之外應(yīng)該還有其他的受體蛋白。5.Ran基因克隆、蛋白原核表達(dá)及功能研究前期研究表明,對蝦和果蠅小G蛋白Ran參與了病毒吞噬過程。本研究進(jìn)一步探討Ran介導(dǎo)螺原體的吞噬作用,揭示Ran調(diào)控細(xì)胞吞噬的分子機(jī)制。首先,利用質(zhì)譜所得肽段序列設(shè)計簡并引物擴(kuò)增Ran基因的中間序列,并通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到基因全長。然后,通過體外細(xì)菌結(jié)合實驗證實Ran蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。最后,合成Ran特異性雙鏈RNA,觀察Ran基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明MrRan-dsRNA注射組中螺原體拷貝數(shù)明顯少于對照組,該組中羅氏沼蝦存活率也要高于兩個對照組。推測羅氏沼蝦Ran蛋白作為胞內(nèi)受體蛋白參與了S. eriocheiris的吞噬過程,MrRan可能參與了吞噬作用中異物攝入過程。6. Far-western印記篩選螺原體配體蛋白及配體蛋白功能驗研究通過Far Western印記篩選Beta-Actin及LGBP的配體蛋白,Beta-Actin的候選配體蛋白為轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase), LGBP蛋白的候選配體蛋白分別為烯醇酶(enolase)、轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)和RNA聚合酶β亞基(DNA directed RNA polymerase subunit beta)。體外培養(yǎng)羅氏沼蝦血細(xì)胞,螺原體感染之前孵育純化的重組配體蛋白,結(jié)果烯醇酶能夠有效抑制螺原體的侵染,羅氏沼蝦血細(xì)胞存活率提高20個百分點,轉(zhuǎn)酮醇酶和乙醛脫氫酶對血細(xì)胞存活率影響不顯著。Western檢測表明烯醇酶在螺原體膜蛋白及胞質(zhì)蛋白中均有分布。我們推測烯醇酶參與了螺原體黏附蝦血細(xì)胞過程,通過與羅氏沼蝦LGBP蛋白的結(jié)合促進(jìn)螺原體的黏附及侵染。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S945.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 羅氏沼蝦養(yǎng)殖現(xiàn)狀及其產(chǎn)業(yè)所面臨問題
        1.1.1 羅氏沼蝦養(yǎng)殖現(xiàn)狀
        1.1.2 羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)所面臨問題
    1.2 螺原體研究概述
        1.2.1 螺原體的發(fā)現(xiàn)與報道
        1.2.2 螺原體分類地位及生物學(xué)特性研究
        1.2.3 螺原體的生物多樣性
        1.2.4 螺原體侵染機(jī)理研究進(jìn)展
    1.3 水產(chǎn)甲殼動物螺原體研究進(jìn)展
        1.3.1 水產(chǎn)甲殼動物螺原體的發(fā)現(xiàn)與證實
        1.3.2 羅氏沼蝦螺原體研究進(jìn)展
        1.3.3 中華絨螯蟹螺原體侵染機(jī)理研究
    1.4 水產(chǎn)甲殼類動物先天性免疫研究進(jìn)展
        1.4.1 免疫反應(yīng)的啟動
        1.4.2 體液免疫
        1.4.3 細(xì)胞免疫
    1.5 小G蛋白研究進(jìn)展
        1.5.1 小G蛋白簡介
        1.5.2 Ran蛋白結(jié)構(gòu)特點
        1.5.3 Ran生物學(xué)功能研究
    1.6 本論文的研究目的、內(nèi)容、意義和技術(shù)路線
        本文主要研究內(nèi)容
        本論文的實驗技術(shù)路線
第2章 iTRAQ篩選螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞的差異蛋白
    2.1 材料和方法
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要器材及設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 實驗方法
    2.2 實驗結(jié)果
        2.2.1 螺原體感染檢測
        2.2.2 總蛋白濃度測定及電泳檢測
        2.2.3 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果
    2.3 討論
第3章 Far-western印跡篩選羅氏沼蝦受體蛋白
    3.1 材料
        3.1.1 主要設(shè)備
        3.1.2 主要試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 羅氏沼蝦血細(xì)胞總蛋白提取
        3.2.2 螺原體菌液處理
        3.2.3 BCA法測定蛋白濃度
        3.2.4 Far-western印記篩選羅氏沼蝦血細(xì)胞受體蛋白
        3.2.5 蛋白萃取與質(zhì)譜鑒定
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 羅氏沼蝦血細(xì)胞及螺原體菌液蛋白濃度測定
        3.3.2 Far-Western印記篩選宿主受體蛋白
        3.3.3 蛋白質(zhì)譜測序結(jié)果
    3.4 討論
第4章 Beta-Actin蛋白原核表達(dá)及受體功能驗證
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要器材及設(shè)備
        4.1.2 主要試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 Beta-Actin基因擴(kuò)增
        4.2.2 Beta-Actin基因與pGEX-6P-1載體連接
        4.2.3 pGEX-Beta-Actin連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至克隆感受態(tài)細(xì)胞
        4.2.4 菌落PCR鑒定陽性克隆、測序分析
        4.2.5 重組質(zhì)粒原核表達(dá)
        4.2.6 重組蛋白過柱純化
        4.2.7 Western blot分析蛋白純化結(jié)果
        4.2.8 Beta-Actin重組蛋白與螺原體體外結(jié)合實驗
        4.2.9 激光共聚焦驗證羅氏沼蝦血細(xì)胞Beta-Actin與螺原體相互作用
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 Beta-Actin基因擴(kuò)增
        4.3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.3 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
        4.3.4 重組蛋白與螺原體體外結(jié)合
        4.3.5 激光共聚焦驗證共定位
    4.4 討論
第5章 LGBP蛋白原核表達(dá)及受體功能驗證
    5.1 實驗材料
        5.1.1 主要器材及設(shè)備
        5.1.2 主要試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 LGBP蛋白表達(dá)、純化及驗證
        5.2.2 抗LGBP鼠多克隆抗體制備
        5.2.3 LGBP重組蛋白與螺原體體外結(jié)合實驗
        5.2.4 激光共聚焦驗證羅氏沼蝦血細(xì)胞LGBP與螺原體相互作用
        5.2.5 LGBP雙鏈RNA合成及純化
        5.2.6 羅氏沼蝦LGBP基因干擾
        5.2.7 LGBP基因干擾對于螺原感染的影響
        5.2.8 羅氏沼蝦死亡率統(tǒng)計
        5.2.9 螺原體侵染期間羅氏沼蝦LGBP基因表達(dá)變化
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 LGBP基因擴(kuò)增
        5.3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.3.3 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
        5.3.4 重組蛋白與螺原體體外結(jié)合
        5.3.5 激光共聚焦驗證共定位
        5.3.6 MrLGBP雙鏈RNA合成
        5.3.7 MrLGBP基因干擾效果檢測
        5.3.8 MrLGBP基因干擾對螺原體侵染數(shù)量的影響
        5.3.9 MrLGBP基因干擾后感染螺原體統(tǒng)計羅氏沼蝦死亡率
        5.3.10 MrLGBP基因干擾后感染螺原體檢測MrLGBP基因表達(dá)變化
    5.4 討論
第6章 Ran基因克隆、蛋白原核表達(dá)及功能研究
    6.1 實驗材料
        6.1.1 主要器材及設(shè)備
        6.1.2 主要試劑
    6.2 實驗方法
        6.2.1 Ran簡并引物設(shè)計
        6.2.2 中間部分cDNA序列擴(kuò)增
        6.2.3 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)擴(kuò)增基因全長
        6.2.4 Ran蛋白表達(dá)、純化及驗證
        6.2.5 Ran重組蛋白與螺原體體外結(jié)合實驗
        6.2.6 Ran雙鏈RNA合成及純化
        6.2.7 羅氏沼蝦Ran基因干擾
        6.2.8 Ran基因干擾對于螺原侵染的影響
        6.2.9 羅氏沼蝦死亡率統(tǒng)計
    6.3 實驗結(jié)果
        6.3.1 Ran簡并引物設(shè)計及部分cDNA序列擴(kuò)增
        6.3.2 RACE擴(kuò)增Ran cDNA序列全長
        6.3.3 MrRan cDNA序列分析
        6.3.4 MrRan蛋白原核表達(dá)及純化
        6.3.5 MrRan重組蛋白與螺原體體外結(jié)合
        6.3.6 MrRan基因干擾效果檢測
        6.3.7 MrRan基因干擾對螺原體侵染數(shù)量的影響
        6.3.8 MrRan基因干擾后感染螺原體統(tǒng)計羅氏沼蝦死亡率
    6.4 討論
第7章 Far-western印跡篩選螺原體配體蛋白及配體蛋白功能驗證
    7.1 實驗材料
        7.1.1 主要器材及設(shè)備
        7.1.2 主要試劑
    7.2 實驗方法
        7.2.1 中華絨螯蟹螺原體總蛋白提取
        7.2.2 Far-Western印記篩選螺原體配體蛋白
        7.2.3 蛋白萃取與質(zhì)譜鑒定
        7.2.4 螺原體基因組DNA的提取
        7.2.5 配體蛋白重組表達(dá)
        7.2.6 配體蛋白競爭性實驗
        7.2.7 烯醇酶在螺原體不同組分中分布
    7.3 實驗結(jié)果
        7.3.1 螺原體總蛋白提取
        7.3.2 Far-Western印記篩選螺原體配體蛋白
        7.3.3 配體蛋白質(zhì)譜測序結(jié)果
        7.3.4 重組質(zhì)粒堿基突變
        7.3.5 重組蛋白的表達(dá)、純化
        7.3.6 配體蛋白質(zhì)競爭性實驗
        7.3.7 烯醇酶在螺原體中分布情況
    7.4 討論
第8章 結(jié)論
    8.1. iTRAQ篩選螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞的差異蛋白
    8.2. Far-western印跡篩選羅氏沼蝦受體蛋白
    8.3. Beta-Actin蛋白原核表達(dá)及受體功能驗證
    8.4. LGBP蛋白原核表達(dá)及受體功能研究
    8.5. Ran基因克隆、蛋白原核表達(dá)及功能研究
    8.6. Far-western印記篩選螺原體配體蛋白及配體蛋白功能驗研究
    本研究的主要創(chuàng)新點
    進(jìn)一步研究方向
附錄A
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2842137