三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我國(guó)特有的淡水育珠蚌,近幾年來(lái)淡水珍珠產(chǎn)量的95%都是來(lái)自于三角帆蚌。在三角帆蚌的貝殼和珍珠的研究中,鑒定和分析基質(zhì)蛋白的組成和功能對(duì)理解其珍珠質(zhì)的形成機(jī)理具有非常重要的意義。以前所研究的貝殼基質(zhì)蛋白大都是從海水貝類(lèi)中分離鑒定的,有關(guān)淡水貝類(lèi)貝殼基質(zhì)蛋白的研究還比較少。本研究從三角帆蚌外套膜中分離鑒定得到了一個(gè)新的貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。1.對(duì)三角帆蚌silkmapin基因進(jìn)行了克隆、序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、組織表達(dá)分析及原位雜交檢測(cè)。運(yùn)用RACE技術(shù)得到該基因c DNA序列的全長(zhǎng)為1242bp,擁有一個(gè)978bp的開(kāi)放閱讀框。該基因編碼一個(gè)30.89KD的蛋白質(zhì),主要含有甘氨酸(Gly),占整個(gè)分量的34.41%,序列中所含的天冬氨酸(Asp)主要集中在C末端,推測(cè)silkmapin的C末端具有結(jié)合Ca2+的能力。二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)結(jié)果表明silkmapin主要為β折疊,高級(jí)結(jié)構(gòu)為一細(xì)絲狀蛋白質(zhì)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明silkmapin只在外套膜的邊緣外褶和緣膜部的上皮細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行原位雜交檢測(cè),結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果一致,在外套膜邊緣和緣膜部的上皮細(xì)胞中檢測(cè)到了強(qiáng)烈的信號(hào),實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交的結(jié)果可以說(shuō)明silkmapin參與了三角帆蚌貝殼珍珠層和棱柱層的形成。2.通過(guò)貝殼修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究silkmapin在貝殼生物礦化中的作用。將三角帆蚌進(jìn)行活體破殼處理,破殼的一邊作為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)有兩個(gè)對(duì)照組,對(duì)外套膜組織和修復(fù)殼樣品進(jìn)行收集,修復(fù)出的新殼用以進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察,外套膜組織樣品用以熒光定量表達(dá)分析。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示三角帆蚌貝殼生長(zhǎng)過(guò)程是由外而內(nèi)逐層生長(zhǎng),生長(zhǎng)順序依次為角質(zhì)層—棱柱層—珍珠層。薄薄的角質(zhì)層最先完成生長(zhǎng),之后棱柱層文石晶體顆粒在角質(zhì)層表面生長(zhǎng),棱柱層晶體生長(zhǎng)是在橫向和縱向兩個(gè)方向上同時(shí)進(jìn)行。棱柱層達(dá)到成熟后,片狀的正六邊形文石珍珠層晶體在其上開(kāi)始堆積,從棱柱層生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向珍珠層時(shí)候無(wú)明顯的過(guò)渡期。還發(fā)現(xiàn)棱柱層生長(zhǎng)符合“擠壓假說(shuō)”的特點(diǎn),而珍珠層則是典型的“磚墻型”結(jié)構(gòu)。結(jié)合掃描電鏡觀察和在不同時(shí)期外套膜中表達(dá)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在棱柱層和珍珠層生長(zhǎng)的時(shí)期,silkmapin在破殼實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組,說(shuō)明silkmapin的確參與了三角帆蚌貝殼棱柱層和珍珠層的礦化過(guò)程。3.通過(guò)插片實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究silkmapin在三角帆蚌珍珠形成過(guò)程中的作用。選取了健康規(guī)格相同的三角帆蚌進(jìn)行無(wú)核珍珠插核手術(shù),定期進(jìn)行珍珠囊組織樣品采集和珍珠小顆粒的收集,珍珠囊組織樣品用以進(jìn)行熒光定量組織表達(dá)分析;珍珠小顆粒經(jīng)過(guò)處理后放在掃描電子顯微鏡(SEM)下進(jìn)行表面形貌的觀察。掃描電鏡觀察的結(jié)果表明三角帆蚌珍珠的礦化生長(zhǎng)過(guò)程分為碳酸鈣無(wú)序沉積和有序沉積兩個(gè)階段。這兩個(gè)階段珍珠顆粒的表面形貌變化也很明顯,從一開(kāi)始的凹凸不平、雜亂堆積到后來(lái)的平整光滑、有序堆疊。結(jié)合電鏡觀察和在不同時(shí)期珍珠囊中表達(dá)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)silkmapin在珍珠成核期的表達(dá)量呈現(xiàn)一個(gè)逐步上升的趨勢(shì),碳酸鈣有序沉積階段的表達(dá)量高于無(wú)序沉積階段,在珍珠層最初形成期表達(dá)量最高。這說(shuō)明silkmapin在三角帆蚌珍珠礦化的過(guò)程起關(guān)鍵的調(diào)控作用,既參與了珍珠質(zhì)形成必不可少的碳酸鈣成核過(guò)程,也調(diào)控了珍珠層文石小片的生長(zhǎng)堆疊。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S917.4
【部分圖文】：

角質(zhì)層處于最外側(cè)，棱柱層位于中間，珍珠層在最里邊。在掃描電子顯微鏡下觀察棱柱層的表面，呈現(xiàn)出不規(guī)則多邊形的長(zhǎng)柱狀晶體結(jié)構(gòu)，猶如皮革的紋理（圖1.1）。珍珠層在電子掃描顯微鏡下呈現(xiàn)出的是規(guī)則的六邊形片狀晶體，小片與小片相連，并成層狀堆積的態(tài)勢(shì)（圖 1.1）。

表 2-1：silkmapin 的氨基酸組成Table 2-1：Amino acid composition of silkmapinAmino acid Number Percent of totalamino acidsGly 107 34.41Val 26 8.36Ser 24 7.72Phe 18 5.79Thr 18 5.79Pro 17 5.47Tyr 17 5.47Ala 16 5.14Asp 14 4.5Leu 10 3.22Ile 10 3.22Arg 8 2.57Asn 6 1.93Lys 5 1.61Gln 3 0.96Met 3 0.96

圖 2-2：silkmapin 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，主要以 β 折疊為主Fig.2-2：Secondary structure prediction of silkmapin, folding mainly β
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2835718