蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)自20世紀(jì)80年代初引入中國后迅速開展增養(yǎng)殖研究和實踐。最近十年,蝦夷扇貝出現(xiàn)了成長速度慢,苗產(chǎn)量低及大規(guī)模死亡等問題,使蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)受到了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重制約了我國貝類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此對貝類免疫系統(tǒng)的探索能有助于我們有效的控制扇貝疾病,從而更好的發(fā)展貝類養(yǎng)殖業(yè)。本文從已構(gòu)建的蝦夷扇貝c DNA文庫中獲得了2個ESTs序列,并設(shè)計相關(guān)的特異性引物,結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到了這2個脅迫基因的完整c DNA序列,并對獲得的全長序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測。本論文針對這2個脅迫基因所做的主要研究內(nèi)容如下:1.蝦夷扇貝酚氧化酶基因克隆、序列分析及表達(dá)特性研究酚氧化酶是一種含銅的金屬酶,廣泛分布于微生物、動植物及人體中。該酶在無脊椎動物先天免疫防御中起著重要的作用。本文用分子克隆技術(shù)得到了蝦夷扇貝酚氧化酶(TYR)c DNA基因全序列(Gen Bank登錄號為KM408317),并利用Real-Time PCR方法分析了酚氧化酶基因在蝦夷扇貝不同組織中表達(dá)概況以及鰻弧菌(Vibrioanguillarum)注射后不同時段的相對表達(dá)量。實驗得到的酚氧化酶基因全長1850 bp,其包括長為1470 bp的開放閱讀框,編碼489個氨基酸,5’UTR和3’UTR分別為37 bp和343 bp。實時定量分析研究顯示,酚氧化酶基因在肝胰腺、外套膜、腎、閉殼肌、鰓和血中都有表達(dá),其中外套膜表達(dá)最高。鰻弧菌注射后6 h,TYR基因表達(dá)量顯著低于對照組,而注射后12-36h,TYR基因表達(dá)量顯著高于對照組,這一數(shù)據(jù)說明該基因可能在免疫過程中發(fā)揮重要作用2.蝦夷扇貝熱休克蛋白60基因克隆、序列分析、表達(dá)及甲基化狀態(tài)研究HSP60(heat shock protein 60,熱休克蛋白60)作為高度保守的熱休克蛋白家族的一員,不僅可以在應(yīng)激狀態(tài)下幫助其他蛋白正確折疊并恢復(fù)天然構(gòu)象,還可作為危險信號作用于天然免疫系統(tǒng)�；贖SP60的轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計特異引物,采用RACE技術(shù)成功克隆獲得蝦夷扇貝熱休克蛋白60(HSP60)c DNA全序列(Gen Bank登錄號為KP398510)。其c DNA序列全長3368 bp,包括68 bp的5’UTR,1569bp的3’UTR和1731 bp的開放閱讀框,共編碼576個氨基酸。利用基因步移技術(shù)擴(kuò)增HSP60基因啟動子區(qū)域序列并測序,獲得HSP60基因啟動子區(qū)域序列1236 bp,使用Ali Bata 2.1軟件預(yù)測出該區(qū)域包含2個TATA盒,4個CCAAT盒,3個熱激元件。通過比對10個扇貝啟動子序列,并未發(fā)現(xiàn)了假定的SNP位點。基于氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與傳統(tǒng)物種進(jìn)化規(guī)律基本吻合。通過實時PCR檢測發(fā)現(xiàn)HSP60在蝦夷扇貝各組織中均有表達(dá),升溫后腎臟中該基因的轉(zhuǎn)錄量升高極顯著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和閉殼肌中的轉(zhuǎn)錄量升高顯著(P0.05),說明該基因在熱應(yīng)激過程中發(fā)揮一定作用。通過BSP方法對蝦夷扇貝DNA啟動子區(qū)域及編碼區(qū)甲基化程度進(jìn)行了檢測與分析,實驗結(jié)果表明蝦夷扇貝DNA甲基化發(fā)生在基因內(nèi)部,即啟動子區(qū)域并沒有甲基化位點,而在編碼區(qū)發(fā)生了甲基化。
【學(xué)位單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 蝦夷扇貝概況
        1.1.1 蝦夷扇貝分類學(xué)地位和形態(tài)學(xué)特征
        1.1.2 我國蝦夷扇貝養(yǎng)殖現(xiàn)狀和面臨的問題
        1.1.3 蝦夷扇貝的病害防治
        1.1.4 蝦夷扇貝的分子生物學(xué)研究
    1.2 無脊椎動物先天性免疫
    1.3 蝦夷扇貝酚氧化酶基因的研究現(xiàn)狀
    1.4 蝦夷扇貝熱休克蛋白60基因的研究現(xiàn)狀
    1.5 本研究的目的和意義
        1.5.1 本研究的目的
        1.5.2 本研究的意義
第二章 TYR基因克隆、序列分析、表達(dá)特性研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗樣品
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 RNA的提取
        2.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 TYR基因全序列的獲得
            2.2.3.1 3’FULLRACE
            2.2.3.2 5’FULLRACE
        2.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
        2.2.5 TYR基因相對轉(zhuǎn)錄量的測定
            2.2.5.1 定量引物設(shè)計以及相關(guān)性驗證
            2.2.5.2 TYR基因在不用組織中的相對轉(zhuǎn)錄量
            2.2.5.3 鰻弧菌對蝦夷扇貝鰓中TYR基因轉(zhuǎn)錄水平影響的測定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 RNA的提取
        2.3.2 TYR全序列的獲得及序列分析
        2.3.3 蝦夷扇貝TYR氨基酸序列同源分析
        2.3.4 TYR序列同源性分析見圖 4，參與比對的物種如下:
        2.3.5 TYR相對轉(zhuǎn)錄量的測定
            2.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性和產(chǎn)物單一性檢驗
            2.3.5.2 TYR基因在不同組織中的相對轉(zhuǎn)錄量
            2.3.5.3 鰻弧菌注射后鰓中TYR基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
    2.4 討論
第三章 HSP60基因克隆、序列分析、表達(dá)及甲基化狀態(tài)研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗樣品
        3.1.2 實驗儀器
        3.1.3 實驗試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.2 HSP60基因全序列的獲得
        3.2.3 HSP60基因啟動子區(qū)域序列的獲得
            3.2.3.1 DNA的提取
            3.2.3.2 第一個內(nèi)含子邊界的確定
            3.2.3.3 基因步移特異性引物設(shè)計的原則
            3.2.3.4 基因步移
            3.2.3.5 查找HSP60啟動子當(dāng)中假定SNP位點
        3.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
        3.2.5 HSP60基因相對轉(zhuǎn)錄量的測定
            3.2.5.1 定量引物設(shè)計以及相關(guān)性驗證
            3.2.5.2 HSP60基因在不同組織中的相對轉(zhuǎn)錄量
            3.2.5.3 溫度對蝦夷扇貝鰓中HSP60基因轉(zhuǎn)錄水平影響的測定
        3.2.6 HSP60甲基化狀態(tài)研究
            3.2.6.1 DNA亞硫酸氫鈉修飾
            3.2.6.2 PCR擴(kuò)增
            3.2.6.3 查找HSP60甲基化位點
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 總RNA的提取
        3.3.2 HSP60全序列的獲得及序列分析
        3.3.3 HSP60啟動子序列的獲得
        3.3.4 HSP60基因啟動子多樣性分析
        3.3.5 HSP60氨基酸序列同源分析
        3.3.6 HSP60相對轉(zhuǎn)錄量的測定
            3.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性和產(chǎn)物單一性檢驗
            3.3.6.2 HSP60基因升溫前后不同組織中的相對轉(zhuǎn)錄量
        3.3.7 HSP60甲基化狀態(tài)分析
    3.4 討論
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：2834481