熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一種應激蛋白,在外界環(huán)境刺激下產生的。按其分子大小可分為多個家族,分別具有不同的生物學特性。其中,HSP70和HSP90家族,均已報道具有分子伴侶的功能,在機體中提呈抗原而提高免疫效果,幫助蛋白完成正確的空間構象,對新生肽鏈具有識別、折疊、裝配、運轉、成熟等功能。對細胞具有抗凋亡、促增殖的作用。錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)能夠引發(fā)鯉魚發(fā)生高致病性的錦鯉皰疹病毒病(Koi Herpesvirus Diease,KHVD),病毒傳播迅速,致死率極高。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)已經將KHVD列為必需報告的疾病。在以往的研究中,多個開放閱讀框已經被成功克隆,且被證實具有一定的免疫原性,但免疫效果一直沒有很好的突破。因此,探索一種高免疫效果的疫苗已經迫在眉睫。本研究根據Genebank登錄的HSP70與HSP90 cDNA序列,利用Primer Premiers 5.0軟件設計兩對特異性引物,通過PCR克隆獲得了240 bp的HSP70基因和687 bp的HSP90基因。將兩段基因分別插入到pMD19-T載體中,通過PCR和雙酶切鑒定后,確定克隆質粒pMD19-T-HSP70、pMD19-T-HSP90構建成功。經生物公司測序,結果表明,克隆獲得的基因片段與鯉魚HSP70與HSP90同源性達99%。分別將兩段基因與表達載體pEGFP-C1連接,經PCR和雙酶切鑒定,成功構建重組表達質粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90。將兩種重組表達質粒與不同劑量的轉染試劑EndoFectionTM Max混合后轉染鯉魚肌肉細胞,通過熒光倒置顯微鏡觀察,重組表達質粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90在細胞中成功表達。以多種免疫劑量的重組表達質粒與pIRES-ORF81混合對鯉魚進行肌肉注射,每周免疫一次,共免疫三次,免疫前采血,收集血清,通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗體水平。結果表明:于第三次免疫后兩周,抗體水平達到最高,聯合免疫與單獨免疫pIRES-ORF81相比,抗體水平明顯升高,但差異不顯著。攻毒實驗結果顯示:與單獨免疫核酸疫苗組相比,聯合免疫組保護率相對較高。通過病理組織切片觀察,單獨免疫核酸疫苗組與聯合免疫組均未發(fā)現明顯病理變化。
【學位單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S943
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1 熱休克蛋白的研究進展
    2 錦鯉皰疹病毒的研究進展
    3 綠色熒光蛋白
    4 本研究的目的與意義
第二章 鯉魚HSP70、HSP90基因的克隆與真核表達載體的構建
    1 材料和方法
    2 方法
    3 結果
    4 討論
    5 小結
第三章 真核表達質粒PEGFP-C1-HSP70和PEGFP-C1-HSP90免疫佐劑效果的研究
    1 材料
    2 方法
    3 結果
    4 討論
    5 小結
結論
參考文獻
作者簡介
致謝

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