熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一種應(yīng)激蛋白,在外界環(huán)境刺激下產(chǎn)生的。按其分子大小可分為多個(gè)家族,分別具有不同的生物學(xué)特性。其中,HSP70和HSP90家族,均已報(bào)道具有分子伴侶的功能,在機(jī)體中提呈抗原而提高免疫效果,幫助蛋白完成正確的空間構(gòu)象,對(duì)新生肽鏈具有識(shí)別、折疊、裝配、運(yùn)轉(zhuǎn)、成熟等功能。對(duì)細(xì)胞具有抗凋亡、促增殖的作用。錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)能夠引發(fā)鯉魚(yú)發(fā)生高致病性的錦鯉皰疹病毒病(Koi Herpesvirus Diease,KHVD),病毒傳播迅速,致死率極高。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已經(jīng)將KHVD列為必需報(bào)告的疾病。在以往的研究中,多個(gè)開(kāi)放閱讀框已經(jīng)被成功克隆,且被證實(shí)具有一定的免疫原性,但免疫效果一直沒(méi)有很好的突破。因此,探索一種高免疫效果的疫苗已經(jīng)迫在眉睫。本研究根據(jù)Genebank登錄的HSP70與HSP90 cDNA序列,利用Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,通過(guò)PCR克隆獲得了240 bp的HSP70基因和687 bp的HSP90基因。將兩段基因分別插入到pMD19-T載體中,通過(guò)PCR和雙酶切鑒定后,確定克隆質(zhì)粒pMD19-T-HSP70、pMD19-T-HSP90構(gòu)建成功。經(jīng)生物公司測(cè)序,結(jié)果表明,克隆獲得的基因片段與鯉魚(yú)HSP70與HSP90同源性達(dá)99%。分別將兩段基因與表達(dá)載體pEGFP-C1連接,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90。將兩種重組表達(dá)質(zhì)粒與不同劑量的轉(zhuǎn)染試劑EndoFectionTM Max混合后轉(zhuǎn)染鯉魚(yú)肌肉細(xì)胞,通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察,重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90在細(xì)胞中成功表達(dá)。以多種免疫劑量的重組表達(dá)質(zhì)粒與pIRES-ORF81混合對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行肌肉注射,每周免疫一次,共免疫三次,免疫前采血,收集血清,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗體水平。結(jié)果表明:于第三次免疫后兩周,抗體水平達(dá)到最高,聯(lián)合免疫與單獨(dú)免疫pIRES-ORF81相比,抗體水平明顯升高,但差異不顯著。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與單獨(dú)免疫核酸疫苗組相比,聯(lián)合免疫組保護(hù)率相對(duì)較高。通過(guò)病理組織切片觀察,單獨(dú)免疫核酸疫苗組與聯(lián)合免疫組均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類(lèi)】：S943
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1 熱休克蛋白的研究進(jìn)展
    2 錦鯉皰疹病毒的研究進(jìn)展
    3 綠色熒光蛋白
    4 本研究的目的與意義
第二章 鯉魚(yú)HSP70、HSP90基因的克隆與真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料和方法
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-HSP70和PEGFP-C1-HSP90免疫佐劑效果的研究
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
致謝

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