20世紀(jì)80年代,全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入了鼎盛時期,對蝦養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧s化養(yǎng)殖模式。由于對蝦養(yǎng)殖密度高,防治技術(shù)相對落后,導(dǎo)致對蝦病毒性疾病的廣泛暴發(fā),使對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大沖擊。近年來我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)依然受到諸如對蝦白斑綜合征(White Spot Disease,WSD)、傳染性皮下及造血組織壞死病(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis,IHHN)和桃拉綜合征(Taura Syndrome,TS)等傳統(tǒng)病毒性疾病的威脅。這三種對蝦病毒性疾病均具有傳播速度快、發(fā)病率高、致死率高的特點,致使感染三種病毒的對蝦品質(zhì)和產(chǎn)量均明顯下降,對蝦養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益損失嚴(yán)重。目前,對蝦病毒性疾病的特效藥仍屬于研究瓶頸,因此檢測和防控是對蝦健康養(yǎng)殖的主要手段。本文對2012年9月-2014年9月江蘇、安徽和廣東地區(qū)的348尾養(yǎng)殖對蝦進(jìn)行了白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)和桃拉綜合征病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)的檢測,分別應(yīng)用套式PCR、一步PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR方法。比對WSSV-TH、WSSV-CN、WSSV-TW和9株實驗室分離的WSSV ORF14/15序列,建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析同源性和差異性。擴(kuò)增IHHNVORF3基因序列,使用生物信息學(xué)軟件分析一株南京分離病毒的疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、抗原表位、糖基化及磷酸化位點,與IHHNV-HI,IHHNV-CA,IHHNV-FJ,IHHNV-TH,IHHNV-TW 和 IHHNV-EC 比對,建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。構(gòu)建 pET32a-ORF3重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)進(jìn)行大量表達(dá),純化pET32a-ORF3融合蛋白。以融合蛋白為抗原分別免疫ICR小鼠和新西蘭白兔,獲得小鼠血清和兔血清,純化血清獲得鼠源多克隆抗體IgG和兔源多克隆抗體IgG。使用鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體建立IHHNV夾心ELISA法。江蘇、安徽和廣東地區(qū)WSSV陽性率為15.31%,IHHNV陽性率為4.31%,未檢出TSV。WSSVORF14/15基因序列分析發(fā)現(xiàn),9株WSSV可分為2大分支:分支1包括BA、BC、BE、BK、BI;分支2包括AG、SW、PH、JX。兩個分支之間差異率在60%-80%,說明兩個分支間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。IHHNV生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,ORF3基因序列長度為990 bp,編碼329個氨基酸,編碼蛋白親水性強(qiáng),二級結(jié)構(gòu)含有55.9%的a-螺旋、52.0%的β-折疊以及13.4%的β-轉(zhuǎn)角,抗原表位分布較廣泛、抗原性強(qiáng),不存在潛在的N-糖基化位點,存在13個潛在的O-糖基化位點和17個潛在的磷酸化位點,符合衣殼蛋白特征.進(jìn)化樹結(jié)果表明,IHHNV-NJ株的ORF3基因編碼蛋白序列與6株IHHNV序列同源性均高于96%,說明IHHNVORF3編碼蛋白序列保守性強(qiáng).本實驗成功構(gòu)建pET32a-ORF3重組質(zhì)粒,獲得純化的pET32a-ORF3融合蛋白和鼠源多克隆抗體、兔源多克隆抗體。探究IHHNV夾心ELISA法的最佳條件為0.02 mol/L包被液4℃ 12h+37℃ 1h包被鼠抗(1:6400),10%小牛血清37℃封閉1h,抗原作用37℃ 1h,兔抗(1:3200)作用37℃ 1h,為制備IHHNV檢測試劑盒提供了新的方法和基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

圖１－２感染ＷＳＳＶ的對臥逡逑Ｆｉ．邋１－２邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＨＨＮＶ邋ｉｎ邋ｓｈｒｉｍ

W逡逑W Ｓ逡逑圖１－３純化的ＩＨＨＮＶ病毒粒子Ｐ９Ｊ逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＩＨＨＮＶ逡逑電子顯微鏡觀察感染ＷＳＳＶ對砰組織切片和提純的ＷＳＳＶ病毒粒子（圖１￣４），逡逑可觀察到ＷＳＳＶ為巧狀病毒，無包涵體，雙層囊膜，病毒由管狀或分支狀的空衣殼逡逑環(huán)繞，病毒大小為（３８０－２５０）邋ｎｍｘ邋（１５０－７０）邋ｎｍ，核衣殼大小為（３５０－３３０）邋ｎｍｘ邋（６７－５８）逡逑ｎｍ。核衣殼一端伸出一條長尾，內(nèi)部包裹著ＷＳＳＶ的基因組。病毒粒子呈現(xiàn)交叉網(wǎng)逡逑線外觀，由１４圈螺旋粒子環(huán)繞而成，螺旋粒子為８邋ｎｍ，成對平行排列。逡逑■ＢＫＨＢ逡逑圖１＊４邋（Ａ）純化的完整ＷＳＳＶ病毒粒子的電鏡照片逡逑（Ｂ）邋ＷＳＳＶ病毒粒子巧衣亮的電鏡照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｏｆ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＷＳＳＶ邋ｖｉｒｉｏｎｓ（Ａ）；逡逑Ｗ％Ｖ邋ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ（Ｂ）逡逑５逡逑

Ｓｈｉｋｅ等將ＩＨＨＮＶ歸類于細(xì)小病毒科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ），濃核癥病毒亞科逡逑（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ），短濃核癥病毒屬。逡逑W逡逑W Ｓ逡逑圖１－３純化的ＩＨＨＮＶ病毒粒子Ｐ９Ｊ逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＩＨＨＮＶ逡逑電子顯微鏡觀察感染ＷＳＳＶ對砰組織切片和提純的ＷＳＳＶ病毒粒子（圖１￣４），逡逑可觀察到ＷＳＳＶ為巧狀病毒，無包涵體，雙層囊膜，病毒由管狀或分支狀的空衣殼逡逑環(huán)繞，病毒大小為（３８０－２５０）邋ｎｍｘ邋（１５０－７０）邋ｎｍ，核衣殼大小為（３５０－３３０）邋ｎｍｘ邋（６７－５８）逡逑ｎｍ。核衣殼一端伸出一條長尾，內(nèi)部包裹著ＷＳＳＶ的基因組。病毒粒子呈現(xiàn)交叉網(wǎng)逡逑線外觀，由１４圈螺旋粒子環(huán)繞而成，螺旋粒子為８邋ｎｍ，成對平行排列。逡逑■ＢＫＨＢ逡逑圖１＊４邋（Ａ）純化的完整ＷＳＳＶ病毒粒子的電鏡照片逡逑（Ｂ）邋ＷＳＳＶ病毒粒子巧衣亮的電鏡照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｏｆ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＷＳＳＶ邋ｖｉｒｉｏｎｓ（Ａ）；逡逑Ｗ％Ｖ邋ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ（Ｂ）逡逑５逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2822190