本文以中國(guó)明對(duì)蝦Coat-ε、凡納濱對(duì)蝦Clathrin coat AP17和對(duì)蝦Clathrin heavy chain(CHC)為研究對(duì)象,分別克隆出它們的基因序列全長(zhǎng),并進(jìn)一步研究了它們?cè)赪SSV侵染中的作用。主要包括以下三個(gè)部分:第一部分:采用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技術(shù),擴(kuò)增出中國(guó)明對(duì)蝦Coat-ε基因的3’端和5’端序列,拼接獲得基因全長(zhǎng)序列1402 bp,其中開放閱讀框1008 bp,預(yù)測(cè)編碼335個(gè)氨基酸,此氨基酸沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。coat-ε在各組織中都有表達(dá),肌肉中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高。構(gòu)建了coat-ε重組表達(dá)載體,SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的蛋白顯示條帶與預(yù)期大小相符,質(zhì)譜分析確認(rèn)重組蛋白為Coat-ε。Far-Western blotting和ELISA分析顯示Coat-ε蛋白與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白VP26、VP28N、VP28C有結(jié)合作用。流式細(xì)胞分析及細(xì)胞ELISA結(jié)果表明,Coat-ε蛋白抗體抑制WSSV與血細(xì)胞的結(jié)合,體內(nèi)中和試驗(yàn)表明Coat-ε與WSSV及其早期基因ie1和晚期基因vp28基因表達(dá)密切相關(guān),Coat-ε抗體延緩了WSSV對(duì)對(duì)蝦的感染。第二部分:采用RACE法擴(kuò)增出凡納濱對(duì)蝦Clathrin coat AP17(LvCCAP17)的3’端和5’端序列,序列全長(zhǎng)842bp,預(yù)計(jì)編碼142個(gè)氨基酸,生物信息學(xué)分析表明此氨基酸沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。熒光定量PCR分析LvCCAP17在凡納濱對(duì)蝦各組織中均有表達(dá)。感染W(wǎng)SSV后在上皮和肝胰腺組織中LvCCAP17轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯上升。構(gòu)建LvCCAP17重組表達(dá)載體,SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的蛋白顯示條帶與預(yù)期大小相符,質(zhì)譜分析確認(rèn)重組蛋白為CCAP17。Far-Western blotting和ELISA分析顯示,LvCCAP17與WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白VP26、VP37具有結(jié)合作用。RNA干擾(RNAi)實(shí)驗(yàn)表明AP17基因沉默后,感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦累積死亡率降低,并且ie1和VP28基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下降。這些結(jié)果顯示,網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與WSSV的感染。第三部分:通過GeneBank上發(fā)布的斑節(jié)對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈(CHC)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增中國(guó)明對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈(Fenneropenaeus chinensis clathrin heavy chain,FcCHC)和凡納濱對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈(Litopenaeus vannamei clathrin heavy chain,LvCHC)序列全長(zhǎng)。獲得LvCHC和FcCHC序列全長(zhǎng)是5052 bp,預(yù)計(jì)編碼1684個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明,LvCHC和FcCHC均為疏水性蛋白,無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽,LvCHC和FcCHC的功能域與其它物種有差別。RNAi實(shí)驗(yàn)表明,CHC沉默后,凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV的累積死亡率降低,說明CHC可能參與WSSV感染宿主細(xì)胞的過程。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S945.4

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本文編號(hào)：2807714