本文以中國明對蝦Coat-ε、凡納濱對蝦Clathrin coat AP17和對蝦Clathrin heavy chain(CHC)為研究對象,分別克隆出它們的基因序列全長,并進一步研究了它們在WSSV侵染中的作用。主要包括以下三個部分:第一部分:采用cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技術,擴增出中國明對蝦Coat-ε基因的3’端和5’端序列,拼接獲得基因全長序列1402 bp,其中開放閱讀框1008 bp,預測編碼335個氨基酸,此氨基酸沒有信號肽和跨膜結構。構建系統(tǒng)發(fā)育樹。coat-ε在各組織中都有表達,肌肉中的相對轉錄表達量最高。構建了coat-ε重組表達載體,SDS-PAGE檢測表達的蛋白顯示條帶與預期大小相符,質譜分析確認重組蛋白為Coat-ε。Far-Western blotting和ELISA分析顯示Coat-ε蛋白與WSSV結構蛋白VP26、VP28N、VP28C有結合作用。流式細胞分析及細胞ELISA結果表明,Coat-ε蛋白抗體抑制WSSV與血細胞的結合,體內中和試驗表明Coat-ε與WSSV及其早期基因ie1和晚期基因vp28基因表達密切相關,Coat-ε抗體延緩了WSSV對對蝦的感染。第二部分:采用RACE法擴增出凡納濱對蝦Clathrin coat AP17(LvCCAP17)的3’端和5’端序列,序列全長842bp,預計編碼142個氨基酸,生物信息學分析表明此氨基酸沒有信號肽和跨膜結構。構建系統(tǒng)發(fā)育樹。熒光定量PCR分析LvCCAP17在凡納濱對蝦各組織中均有表達。感染WSSV后在上皮和肝胰腺組織中LvCCAP17轉錄水平的表達量明顯上升。構建LvCCAP17重組表達載體,SDS-PAGE檢測表達的蛋白顯示條帶與預期大小相符,質譜分析確認重組蛋白為CCAP17。Far-Western blotting和ELISA分析顯示,LvCCAP17與WSSV的結構蛋白VP26、VP37具有結合作用。RNA干擾(RNAi)實驗表明AP17基因沉默后,感染WSSV的對蝦累積死亡率降低,并且ie1和VP28基因的轉錄表達下降。這些結果顯示,網格蛋白介導的內吞作用參與WSSV的感染。第三部分:通過GeneBank上發(fā)布的斑節(jié)對蝦網格蛋白重鏈(CHC)設計引物,擴增中國明對蝦網格蛋白重鏈(Fenneropenaeus chinensis clathrin heavy chain,FcCHC)和凡納濱對蝦網格蛋白重鏈(Litopenaeus vannamei clathrin heavy chain,LvCHC)序列全長。獲得LvCHC和FcCHC序列全長是5052 bp,預計編碼1684個氨基酸。生物信息學分析表明,LvCHC和FcCHC均為疏水性蛋白,無跨膜結構和信號肽,LvCHC和FcCHC的功能域與其它物種有差別。RNAi實驗表明,CHC沉默后,凡納濱對蝦感染WSSV的累積死亡率降低,說明CHC可能參與WSSV感染宿主細胞的過程。
【學位單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S945.4

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