發(fā)布時(shí)間：2020-08-28 11:40

【摘要】：牡蠣素有“海洋牛奶”之美稱(chēng),其富含糖原、谷氨酸、�；撬�、鋅、硒、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的物質(zhì),市售的各種牡蠣營(yíng)養(yǎng)制品更是充分體現(xiàn)了牡蠣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而,種質(zhì)退化、養(yǎng)殖管理不善等造成的牡蠣品質(zhì)低下問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重影響了牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,導(dǎo)致牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)整體效益長(zhǎng)期在低水平徘徊。因此,培育生長(zhǎng)快、肥滿(mǎn)度高、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的牡蠣新品種是亟需解決的問(wèn)題。除了生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀,牡蠣夏季大規(guī)模死亡等現(xiàn)象也不容忽視,由此凋亡過(guò)程因其在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、機(jī)體免疫防御等過(guò)程中的重要作用也備受關(guān)注。作為起始凋亡酶,caspase-8在脊椎動(dòng)物外源性凋亡通路中發(fā)揮承上啟下作用,然而無(wú)脊椎動(dòng)物誘導(dǎo)凋亡的方式卻大相徑庭。相關(guān)生物學(xué)問(wèn)題,如牡蠣中是否存在外源性凋亡通路、牡蠣caspase-8是否具有與脊椎動(dòng)物caspase-8類(lèi)似的功能以及其是否具有免疫功能等都有待研究。長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas),又名太平洋牡蠣,是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi),也是我國(guó)黃渤海區(qū)的主養(yǎng)貝類(lèi)。本次研究把牡蠣生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀以及凋亡酶caspase-8基因作為研究對(duì)象,以長(zhǎng)牡蠣為代表物種展開(kāi)研究。一方面,通過(guò)群體與家系構(gòu)建,通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析的方法,將生長(zhǎng)、糖原、氨基酸、脂肪酸等表型性狀與SNP、單倍型等分子標(biāo)記建立聯(lián)系,為相應(yīng)品質(zhì)性狀的遺傳改良提供大量候選標(biāo)記與關(guān)鍵基因,以期對(duì)品質(zhì)性狀遺傳機(jī)制進(jìn)行解析,為分子育種奠定基礎(chǔ);另一方面,針對(duì)長(zhǎng)牡蠣caspase-8基因,檢測(cè)其是否與外源性凋亡通路接頭蛋白FADD相互作用,并分析其在不同時(shí)空(不同組織、發(fā)育時(shí)期)和不同病理?xiàng)l件下(細(xì)菌、病毒刺激)的表達(dá)模式,以期對(duì)長(zhǎng)牡蠣caspase-8基因的凋亡及免疫功能作出解釋,并為無(wú)脊椎動(dòng)物凋亡信號(hào)規(guī)律提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)價(jià)值。論文的主要內(nèi)容及結(jié)論如下:1.牡蠣生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀的遺傳解析(1)生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析將采自世界5個(gè)國(guó)家23個(gè)地點(diǎn)的長(zhǎng)牡蠣,與青島當(dāng)?shù)氐囊粋�(gè)父本雜交,同步構(gòu)建了427個(gè)半同胞家系,子一代在青島同海域同環(huán)境養(yǎng)殖。一方面,通過(guò)全基因組重測(cè)序?qū)δ副具M(jìn)行基因分型,另一方面用子一代的表型均值代表母本,在牡蠣1.5歲時(shí)采集生長(zhǎng)、糖原、氨基酸、脂肪酸等表型信息,通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析,其中19性狀一共找到33個(gè)陽(yáng)性信號(hào),進(jìn)一步通過(guò)LD(Linkage disequilibrium)區(qū)間內(nèi)的基因解讀,鑒定出一批與性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因,尤其是脂肪酸性狀關(guān)聯(lián)到的直接參與脂肪酸代謝及調(diào)控的相應(yīng)基因,如NFYA、CYP7A1等,具極大的分子育種價(jià)值。(2)遺傳圖譜構(gòu)建與生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL(Quantitative trait locus)定位分別以昌黎和青島長(zhǎng)牡蠣個(gè)體為母本和父本,構(gòu)建全同胞家系,并從中隨機(jī)選取169個(gè)體,結(jié)合雙酶切GBS(Genotyping by sequencing)等方法構(gòu)建遺傳圖譜。5024個(gè)單倍型標(biāo)記均勻分布于整合圖譜的10條連鎖群,圖譜總長(zhǎng)1982.07 c M,獨(dú)特位點(diǎn)平均間距0.68 c M,是目前牡蠣中上圖標(biāo)記最多、密度最大圖譜。同時(shí),圖譜與基因組共線性很高,利用圖譜首次將約70%的基因組scaffold定位于連鎖群上。此外,QTL定位結(jié)果顯示,其中17個(gè)性狀共檢測(cè)到41個(gè)QTL,區(qū)間內(nèi)既鑒定出已報(bào)道與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的基因,也找到許多直接參與氨基酸、脂肪酸代謝調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因,其中,生長(zhǎng)、氨基酸和脂肪酸性狀共6個(gè)候選基因(AMY、BMP1、P5CS、GR、ADAMTS和DYRK)經(jīng)驗(yàn)證可以通過(guò)m RNA表達(dá)水平的變化來(lái)影響相應(yīng)性狀,這6個(gè)基因可作為生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀分子育種的重要目標(biāo)�？偨Y(jié)來(lái)說(shuō),生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析均為性狀的遺傳改良提供大量候選標(biāo)記與關(guān)鍵基因,兩者相輔相成,相互補(bǔ)充。結(jié)合基因功能研究手段,候選基因影響性狀的遺傳機(jī)制將進(jìn)一步坐實(shí)。牡蠣雖具極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,但氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的遺傳解析實(shí)屬首次,所作工作具極大的產(chǎn)業(yè)價(jià)值,尤其GWAS中找到的脂肪酸性狀相關(guān)4個(gè)基因以及連鎖分析鑒定的6個(gè)在m RNA表達(dá)水平上顯著影響性狀的基因,都將作為營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等重要經(jīng)濟(jì)性狀分子育種的重要目標(biāo),加速分子育種進(jìn)程。2.長(zhǎng)牡蠣Cg Caspase8-2基因功能研究本研究克隆了首個(gè)長(zhǎng)牡蠣caspase-8基因Cg Caspase8-2,其具有典型的caspase-8結(jié)構(gòu)域及保守的“QACQG”凋亡酶活性位點(diǎn)。序列比對(duì)及進(jìn)化分析表明,Cg Caspase8-2與其他物種caspase-8之間的一致性較低,在進(jìn)化樹(shù)上屬于無(wú)脊椎動(dòng)物分支。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,Cg Caspase8-2蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)發(fā)揮活性,且HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)CgCaspase8-2會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。但因?yàn)镃g Caspase8-2不與上游接頭分子Cg FADD相互作用,所以推測(cè)其并不參與外源性凋亡通路。需要特別指出的是,Cg Caspase8-2基因在免疫器官鰓和血淋巴中顯著高表達(dá),揭示其潛在的免疫功能,進(jìn)而通過(guò)該基因在長(zhǎng)牡蠣經(jīng)受溶菌弧菌和poly(I:C)病菌刺激后的表達(dá)分析,證明其具有特異性的抗病毒而非抗菌免疫功能。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

中國(guó)沿�！眰�(gè)采樣地點(diǎn)及每地點(diǎn)構(gòu)建參Figure2.1Nineteensamplinglocationsaroundcostalseaofconstructedfamiliesfromeachlocation

圖 2.2 后裔代表親本表型測(cè)定方法混樣個(gè)數(shù)評(píng)估同的性狀，其中 1-6 是生長(zhǎng)性狀和糖原，7-24 是氨基酸性狀，2軸代表重復(fù) 100 次取樣分別與總體均值進(jìn)行 t 檢驗(yàn)后，差異達(dá)到的次數(shù)所占百分比。valuation of sampling number of progeny that can represent thesents different traits. ‘1-6’, ‘7-24’, and ‘25-46’ stands for glycogen a acid traits, and fatty acid traits, respectively. Y-axis represents the p t-test that the phenotype mean of the sampling individuals was signiP < 0.05) from that of the 100 individuals of the family.代合適的混樣量，我們對(duì)不同取樣個(gè)數(shù)對(duì)總體均值的代表2.2）顯示，按取樣個(gè)數(shù)來(lái)看，當(dāng)取樣量 ≤ 15 時(shí)，100 次狀超過(guò) 5 次取樣均值與總體均值（P < 0.05）達(dá)到顯著性0 10 20 30 40 5Random5 Random10 Random15 Random30 Random60 Random90

占脂肪酸總量的 68%（圖 2.7），此外，EPA、DHA 等極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的不和脂肪酸在長(zhǎng)牡蠣中含量也較高，且在個(gè)體間存在豐富差異。圖 2.6 427 個(gè)體氨基酸組成情況Figure 2.6 Amino acid composition of 427 individuals41%59%Glu14%Tau11%Asp10%Lys7%Leu7%Arg7%Gly6%Ala6%Val5%Pro5%Ile4%Ser4%Thr4%Phe4%His3%Tyr2%Cys1%Met0%

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本文編號(hào)：2807536