【摘要】：牡蠣素有“海洋牛奶”之美稱,其富含糖原、谷氨酸、�；撬�、鋅、硒、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等極具營養(yǎng)價值的物質(zhì),市售的各種牡蠣營養(yǎng)制品更是充分體現(xiàn)了牡蠣的營養(yǎng)價值。然而,種質(zhì)退化、養(yǎng)殖管理不善等造成的牡蠣品質(zhì)低下問題已經(jīng)嚴重影響了牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,導(dǎo)致牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)整體效益長期在低水平徘徊。因此,培育生長快、肥滿度高、高營養(yǎng)價值的牡蠣新品種是亟需解決的問題。除了生長與營養(yǎng)品質(zhì)性狀,牡蠣夏季大規(guī)模死亡等現(xiàn)象也不容忽視,由此凋亡過程因其在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、機體免疫防御等過程中的重要作用也備受關(guān)注。作為起始凋亡酶,caspase-8在脊椎動物外源性凋亡通路中發(fā)揮承上啟下作用,然而無脊椎動物誘導(dǎo)凋亡的方式卻大相徑庭。相關(guān)生物學(xué)問題,如牡蠣中是否存在外源性凋亡通路、牡蠣caspase-8是否具有與脊椎動物caspase-8類似的功能以及其是否具有免疫功能等都有待研究。長牡蠣(Crassostrea gigas),又名太平洋牡蠣,是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類,也是我國黃渤海區(qū)的主養(yǎng)貝類。本次研究把牡蠣生長和營養(yǎng)品質(zhì)性狀以及凋亡酶caspase-8基因作為研究對象,以長牡蠣為代表物種展開研究。一方面,通過群體與家系構(gòu)建,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析的方法,將生長、糖原、氨基酸、脂肪酸等表型性狀與SNP、單倍型等分子標記建立聯(lián)系,為相應(yīng)品質(zhì)性狀的遺傳改良提供大量候選標記與關(guān)鍵基因,以期對品質(zhì)性狀遺傳機制進行解析,為分子育種奠定基礎(chǔ);另一方面,針對長牡蠣caspase-8基因,檢測其是否與外源性凋亡通路接頭蛋白FADD相互作用,并分析其在不同時空(不同組織、發(fā)育時期)和不同病理條件下(細菌、病毒刺激)的表達模式,以期對長牡蠣caspase-8基因的凋亡及免疫功能作出解釋,并為無脊椎動物凋亡信號規(guī)律提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)價值。論文的主要內(nèi)容及結(jié)論如下:1.牡蠣生長與營養(yǎng)品質(zhì)性狀的遺傳解析(1)生長與營養(yǎng)品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析將采自世界5個國家23個地點的長牡蠣,與青島當(dāng)?shù)氐囊粋�父本雜交,同步構(gòu)建了427個半同胞家系,子一代在青島同海域同環(huán)境養(yǎng)殖。一方面,通過全基因組重測序?qū)δ副具M行基因分型,另一方面用子一代的表型均值代表母本,在牡蠣1.5歲時采集生長、糖原、氨基酸、脂肪酸等表型信息,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析,其中19性狀一共找到33個陽性信號,進一步通過LD(Linkage disequilibrium)區(qū)間內(nèi)的基因解讀,鑒定出一批與性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因,尤其是脂肪酸性狀關(guān)聯(lián)到的直接參與脂肪酸代謝及調(diào)控的相應(yīng)基因,如NFYA、CYP7A1等,具極大的分子育種價值。(2)遺傳圖譜構(gòu)建與生長、營養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL(Quantitative trait locus)定位分別以昌黎和青島長牡蠣個體為母本和父本,構(gòu)建全同胞家系,并從中隨機選取169個體,結(jié)合雙酶切GBS(Genotyping by sequencing)等方法構(gòu)建遺傳圖譜。5024個單倍型標記均勻分布于整合圖譜的10條連鎖群,圖譜總長1982.07 c M,獨特位點平均間距0.68 c M,是目前牡蠣中上圖標記最多、密度最大圖譜。同時,圖譜與基因組共線性很高,利用圖譜首次將約70%的基因組scaffold定位于連鎖群上。此外,QTL定位結(jié)果顯示,其中17個性狀共檢測到41個QTL,區(qū)間內(nèi)既鑒定出已報道與生長性狀顯著相關(guān)的基因,也找到許多直接參與氨基酸、脂肪酸代謝調(diào)控和轉(zhuǎn)運的基因,其中,生長、氨基酸和脂肪酸性狀共6個候選基因(AMY、BMP1、P5CS、GR、ADAMTS和DYRK)經(jīng)驗證可以通過m RNA表達水平的變化來影響相應(yīng)性狀,這6個基因可作為生長和營養(yǎng)品質(zhì)性狀分子育種的重要目標�？偨Y(jié)來說,生長與營養(yǎng)品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析均為性狀的遺傳改良提供大量候選標記與關(guān)鍵基因,兩者相輔相成,相互補充。結(jié)合基因功能研究手段,候選基因影響性狀的遺傳機制將進一步坐實。牡蠣雖具極高的營養(yǎng)價值,但氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量的遺傳解析實屬首次,所作工作具極大的產(chǎn)業(yè)價值,尤其GWAS中找到的脂肪酸性狀相關(guān)4個基因以及連鎖分析鑒定的6個在m RNA表達水平上顯著影響性狀的基因,都將作為營養(yǎng)品質(zhì)等重要經(jīng)濟性狀分子育種的重要目標,加速分子育種進程。2.長牡蠣Cg Caspase8-2基因功能研究本研究克隆了首個長牡蠣caspase-8基因Cg Caspase8-2,其具有典型的caspase-8結(jié)構(gòu)域及保守的“QACQG”凋亡酶活性位點。序列比對及進化分析表明,Cg Caspase8-2與其他物種caspase-8之間的一致性較低,在進化樹上屬于無脊椎動物分支。亞細胞定位結(jié)果顯示,Cg Caspase8-2蛋白在胞質(zhì)中表達發(fā)揮活性,且HEK293T細胞轉(zhuǎn)染實驗表明,過表達CgCaspase8-2會誘導(dǎo)細胞死亡。但因為Cg Caspase8-2不與上游接頭分子Cg FADD相互作用,所以推測其并不參與外源性凋亡通路。需要特別指出的是,Cg Caspase8-2基因在免疫器官鰓和血淋巴中顯著高表達,揭示其潛在的免疫功能,進而通過該基因在長牡蠣經(jīng)受溶菌弧菌和poly(I:C)病菌刺激后的表達分析,證明其具有特異性的抗病毒而非抗菌免疫功能。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

中國沿海”個采樣地點及每地點構(gòu)建參Figure2.1Nineteensamplinglocationsaroundcostalseaofconstructedfamiliesfromeachlocation

圖 2.2 后裔代表親本表型測定方法混樣個數(shù)評估同的性狀，其中 1-6 是生長性狀和糖原，7-24 是氨基酸性狀，2軸代表重復(fù) 100 次取樣分別與總體均值進行 t 檢驗后，差異達到的次數(shù)所占百分比。valuation of sampling number of progeny that can represent thesents different traits. ‘1-6’, ‘7-24’, and ‘25-46’ stands for glycogen a acid traits, and fatty acid traits, respectively. Y-axis represents the p t-test that the phenotype mean of the sampling individuals was signiP < 0.05) from that of the 100 individuals of the family.代合適的混樣量，我們對不同取樣個數(shù)對總體均值的代表2.2）顯示，按取樣個數(shù)來看，當(dāng)取樣量 ≤ 15 時，100 次狀超過 5 次取樣均值與總體均值（P < 0.05）達到顯著性0 10 20 30 40 5Random5 Random10 Random15 Random30 Random60 Random90

占脂肪酸總量的 68%（圖 2.7），此外，EPA、DHA 等極具營養(yǎng)價值的不和脂肪酸在長牡蠣中含量也較高，且在個體間存在豐富差異。圖 2.6 427 個體氨基酸組成情況Figure 2.6 Amino acid composition of 427 individuals41%59%Glu14%Tau11%Asp10%Lys7%Leu7%Arg7%Gly6%Ala6%Val5%Pro5%Ile4%Ser4%Thr4%Phe4%His3%Tyr2%Cys1%Met0%

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本文編號：2807536