【摘要】：溫度作為影響生物分布的重要因素之一,直接決定了生物體的生理特征和行為。魚類作為最廣泛分布的脊椎動(dòng)物,其如何來適應(yīng)溫度變化一直以來是環(huán)境生物學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。對(duì)斑馬魚和羅非魚進(jìn)行低溫脅迫過程中的研究發(fā)現(xiàn),鰓是最敏感的組織,最容易受到損傷,8℃低溫處理6h和12h有大量高表達(dá)的差異基因參與到凋亡信號(hào)通路中。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在鰓細(xì)胞凋亡過程中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和雙特異性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)在兩種魚的表達(dá)模式不同,并在凋亡信號(hào)通路中起重要調(diào)控作用。基于這些研究,闡明bmp10,dusp1在斑馬魚分子生物學(xué)過程具有重要意義,將有利于我們進(jìn)一步了解魚類低溫應(yīng)激過程中的適應(yīng)機(jī)制。Bmp10是與心臟發(fā)育息息相關(guān)的BMP家族成員,在心臟、神經(jīng)和軟骨發(fā)育過程中具有重要作用。在哺乳動(dòng)物中,初步研究發(fā)現(xiàn),bmp10首先在小鼠胚胎心臟中表達(dá),突變純合體小鼠,會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)育不全,胚胎致死,預(yù)示著bmp10在心臟發(fā)育過程中具有重要調(diào)控功能。但是在斑馬魚胚胎和成體發(fā)育過程中的研究仍不清楚。Dusp1屬于雙特異性磷酸酶,是MAPK家族蛋白的負(fù)調(diào)控基因,參與大量的生理學(xué)活性,包括細(xì)胞信號(hào)傳遞、軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞新陳代謝過程等,抑制其表達(dá)或者誘導(dǎo)高表達(dá)都有可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。斑馬魚作為模式生物,具有個(gè)體小,容易飼養(yǎng),并且基因組全序列已經(jīng)被公布等生物學(xué)優(yōu)點(diǎn),生長(zhǎng)速度快,使得斑馬魚成為我們研究魚類生物學(xué)過程和低溫誘導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制方面的最佳實(shí)驗(yàn)材料。為了揭示bmp10,dusp1與斑馬魚鰓細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,本研究首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚胚胎發(fā)育一細(xì)胞期對(duì)bmp10,dusp1進(jìn)行敲除,經(jīng)TUNEL凋亡檢測(cè)鰓細(xì)胞凋亡情況,并進(jìn)一步用HE檢測(cè)病理變化;其次在斑馬魚胚胎纖維樣ZF4細(xì)胞中進(jìn)行體外驗(yàn)證,對(duì)dusp1進(jìn)行敲降,檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),bmp10敲除型斑馬魚心肌發(fā)育異常,鰓細(xì)胞發(fā)生水腫,低溫應(yīng)激下,加速心肌細(xì)胞壞死,鰓細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重水腫,導(dǎo)致鰓細(xì)胞凋亡。分析發(fā)現(xiàn)bmp10敲除位點(diǎn)在保守區(qū)域,說明在斑馬魚進(jìn)化過程中具有重要調(diào)控作用,對(duì)bmp10進(jìn)行敲除會(huì)影響心臟發(fā)育,進(jìn)而在低溫應(yīng)激下會(huì)加速鰓細(xì)胞發(fā)生凋亡,水腫現(xiàn)象。Dusp1純合突變體斑馬魚,低溫下,鰓細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加,但是鰓小片未檢測(cè)到明顯病理變化。Dusp1敲降型ZF4細(xì)胞低溫下會(huì)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。分析發(fā)現(xiàn)dusp1序列未檢測(cè)到保守區(qū)域,敲除dusp1會(huì)出現(xiàn)其他基因的相互協(xié)同作用,因此dusp1敲除型斑馬魚表型不明顯。總之,本研究證明了bmp10,dusp1參與魚類低溫應(yīng)激過程,在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起到重要調(diào)控作用,敲降或敲除bmp10,dusp1,基因功能缺失,都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bmp10在斑馬魚心臟發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。本研究為后續(xù)研究魚類內(nèi)源性基因表達(dá)和發(fā)生學(xué)變化分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2803122