【摘要】：溫度作為影響生物分布的重要因素之一,直接決定了生物體的生理特征和行為。魚類作為最廣泛分布的脊椎動物,其如何來適應溫度變化一直以來是環(huán)境生物學的一個研究熱點。對斑馬魚和羅非魚進行低溫脅迫過程中的研究發(fā)現(xiàn),鰓是最敏感的組織,最容易受到損傷,8℃低溫處理6h和12h有大量高表達的差異基因參與到凋亡信號通路中。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),在鰓細胞凋亡過程中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和雙特異性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)在兩種魚的表達模式不同,并在凋亡信號通路中起重要調(diào)控作用�；谶@些研究,闡明bmp10,dusp1在斑馬魚分子生物學過程具有重要意義,將有利于我們進一步了解魚類低溫應激過程中的適應機制。Bmp10是與心臟發(fā)育息息相關(guān)的BMP家族成員,在心臟、神經(jīng)和軟骨發(fā)育過程中具有重要作用。在哺乳動物中,初步研究發(fā)現(xiàn),bmp10首先在小鼠胚胎心臟中表達,突變純合體小鼠,會導致心肌發(fā)育不全,胚胎致死,預示著bmp10在心臟發(fā)育過程中具有重要調(diào)控功能。但是在斑馬魚胚胎和成體發(fā)育過程中的研究仍不清楚。Dusp1屬于雙特異性磷酸酶,是MAPK家族蛋白的負調(diào)控基因,參與大量的生理學活性,包括細胞信號傳遞、軟骨細胞生長、細胞新陳代謝過程等,抑制其表達或者誘導高表達都有可能導致細胞發(fā)生凋亡。斑馬魚作為模式生物,具有個體小,容易飼養(yǎng),并且基因組全序列已經(jīng)被公布等生物學優(yōu)點,生長速度快,使得斑馬魚成為我們研究魚類生物學過程和低溫誘導的基因調(diào)控機制方面的最佳實驗材料。為了揭示bmp10,dusp1與斑馬魚鰓細胞凋亡之間的關(guān)系,本研究首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚胚胎發(fā)育一細胞期對bmp10,dusp1進行敲除,經(jīng)TUNEL凋亡檢測鰓細胞凋亡情況,并進一步用HE檢測病理變化;其次在斑馬魚胚胎纖維樣ZF4細胞中進行體外驗證,對dusp1進行敲降,檢測細胞凋亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),bmp10敲除型斑馬魚心肌發(fā)育異常,鰓細胞發(fā)生水腫,低溫應激下,加速心肌細胞壞死,鰓細胞發(fā)生嚴重水腫,導致鰓細胞凋亡。分析發(fā)現(xiàn)bmp10敲除位點在保守區(qū)域,說明在斑馬魚進化過程中具有重要調(diào)控作用,對bmp10進行敲除會影響心臟發(fā)育,進而在低溫應激下會加速鰓細胞發(fā)生凋亡,水腫現(xiàn)象。Dusp1純合突變體斑馬魚,低溫下,鰓細胞凋亡數(shù)顯著增加,但是鰓小片未檢測到明顯病理變化。Dusp1敲降型ZF4細胞低溫下會促進細胞發(fā)生凋亡。分析發(fā)現(xiàn)dusp1序列未檢測到保守區(qū)域,敲除dusp1會出現(xiàn)其他基因的相互協(xié)同作用,因此dusp1敲除型斑馬魚表型不明顯�？傊�,本研究證明了bmp10,dusp1參與魚類低溫應激過程,在細胞凋亡信號通路中起到重要調(diào)控作用,敲降或敲除bmp10,dusp1,基因功能缺失,都會誘導細胞發(fā)生凋亡。Bmp10在斑馬魚心臟發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。本研究為后續(xù)研究魚類內(nèi)源性基因表達和發(fā)生學變化分子機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：2803122