【摘要】：溶藻弧菌是一種分布廣泛的海洋病原菌,生長速度快的特點(diǎn)使其在環(huán)境中能夠占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位。溶藻弧菌能夠感染包括魚類、甲殼類、珊瑚蟲在內(nèi)的多種海洋動(dòng)物,對全球的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。包括溶藻弧菌在內(nèi)的細(xì)菌通常使用一些獨(dú)特的分泌系統(tǒng)適應(yīng)其所在的環(huán)境。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)正是這樣一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的毒力分泌系統(tǒng)。這種多組分的分泌系統(tǒng)介導(dǎo)針對宿主的毒力,也介導(dǎo)細(xì)菌之間的競爭。溶藻弧菌EPGS編碼了兩套T6SS(T6SS1和T6SS2),這兩套T6SS均含有完整的13個(gè)T6SS核心組件。目前對這兩套T6SS的功能知之甚少。我們探索了溶藻弧菌EPGS在平板狀態(tài)下發(fā)揮最優(yōu)殺菌能力的條件,發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌的毒力不局限于大腸桿菌,對其他多種海洋細(xì)菌都有顯著的殺傷作用。共聚焦顯微鏡和殺菌實(shí)驗(yàn)表明,在平板狀態(tài)下,溶藻弧菌EPGS進(jìn)行細(xì)菌競爭主要依賴于T6SS2,而非T6SS1。qRT-PCR和Western blot數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),T6SS2所介導(dǎo)的殺菌活力受到群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)和磷酸激酶PpkA2的調(diào)控。我們采用磷酸化蛋白質(zhì)譜的篩選方法,鑒定與T6SS2活力相關(guān)并依賴于PpkA2的磷酸化底物。與其他細(xì)菌一樣,PpkA2的自磷酸化對T6SS2的功能至關(guān)重要。另一個(gè)鑒定到的T6SS2基因簇內(nèi)蛋白是DotU2,它的兩個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)都可以被PpkA2磷酸化,這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)對p-DotU2是冗余的。p-DotU2能與Fha2結(jié)合,激活T6SS2的分泌。處于T6SS2基因簇外的小蛋白VtsR也能被PpkA2磷酸化。這個(gè)蛋白通過調(diào)控QS中樞元件LuxR的表達(dá),對T6SS2的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響。在溶藻弧菌EPGS中,PpkA2通過控制一系列的磷酸化蛋白底物介導(dǎo)了 T6SS和QS之間的正反饋通路,提高溶藻弧菌的競爭能力。除了激酶PpkA2,溶藻弧菌EPGS的T6SS2基因簇內(nèi),還編碼一個(gè)隸屬于PP2C磷酸酶家族的蛋白PppA。在之前的研究中,PP2C家族磷酸酶主要響應(yīng)壓力應(yīng)激。PppA-PpkA也能調(diào)控其他一些非T6SS的表型。目前,在溶藻弧菌T6SS中PppA扮演的角色還不明確。通過磷酸化質(zhì)譜的篩選,我們發(fā)現(xiàn)PppA的第253位蘇氨酸能被PpkA2磷酸化,同時(shí)PppA的磷酸酶活性會受到PpkA2調(diào)控。在平板狀態(tài)下,p-PppA調(diào)控T6SS2的表達(dá)和活力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明,PppA蛋白和其磷酸化位點(diǎn)通過LuxR調(diào)控T6SS2的活性。本實(shí)驗(yàn)室之前的數(shù)據(jù)表明,在液體環(huán)境中,PppA正調(diào)控LuxR的表達(dá),因子RpoE直接結(jié)合在LuxR的啟動(dòng)子上。通過qRT-PCR,我們發(fā)現(xiàn)PppA在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控luxR和rpoE。借助Tn-seq技術(shù),嘗試尋找了與調(diào)控有關(guān)的基因。通過Tn-seq的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)了一些可能與PppA調(diào)控luxR和rpoE相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和QS相關(guān)基因。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些可能與PppA無關(guān),僅僅是LuxR或RpoE的調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S941.4
【圖文】：

周質(zhì)與ＯｍｐＡ／ＭｏｔＢ類似的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域［４２］。當(dāng)這個(gè)結(jié)構(gòu)不存在時(shí)，該結(jié)構(gòu)的功能逡逑主要由與ＴｓｓＬ相互作用的必需膜蛋白ＴａｇＬ代替［４２］。在２０１５年，１１．６ＡＴｓｓＪＬＭ膜復(fù)合逡逑物的全電子顯微鏡結(jié)構(gòu)被解析（圖１．２）［４３］。逡逑ｇ邐Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ邋ａ逡逑？邐ｔ邐＊邐４逡逑Ｉ逡逑乫削ｔ焌Ｊｉｕｔｔ．ｉｉｍｎｎｎ逡逑、邐ＡＴＰ邋ＡＯ＾逡逑Ｅｘｔｅｎｄｅｄ邐Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ邐？逡逑ｓｔａｔｅ邐＂Ｆ＿〃邐＾ａｓｓｅｍｂｌｙ逡逑（Ａ）邐（Ｂ）邐（Ｃ）逡逑圖１．１邋Ｔ６ＳＳ結(jié)構(gòu)和機(jī)制示意圖１８１逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ．邋（Ａ）邋Ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ａｎｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｃｈｉｎｅｉｙ邋ａｒｅ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｄ．邋（Ｂ）邋Ｓｈｅａｔｈ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ邋ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｐｕｔ邋ｔｈｅ邋ｉｎｎｅｒ邋ｔｕｂｅ邋ｔｏｗａｒｄｓ逡逑ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｃｅｌｌ．邋（Ｃ）邋Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ邋ａｒｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｒ邋ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，邋ｔｈｅｎ邋ＣｌｐＶ邋ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｓ邋ｔｈｅ逡逑ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ邋ｓｈｅａｔｈ．逡逑生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)的研究表明，Ｔ６ＳＳ中心蛋白形成一個(gè)與收縮的噬菌體尾相關(guān)逡逑組件類似的細(xì)胞刺穿結(jié)構(gòu)。Ｔ６ＳＳ的內(nèi)管是由Ｈｅｐ的六聚體構(gòu)建而成

蛋白會導(dǎo)致Ｈｅｐ蛋白不分泌和殺傷能力的缺失，所以只針對同源ＶｇｒＧ的ＰＡＡＲ蛋白逡逑ＴａｇＤ對Ｔ６ＳＳ組裝是至關(guān)重要的［４９］。逡逑圖１．２大腸桿菌Ｔ６ＳＳ的ＴｓｓＪＬＭ復(fù)合物結(jié)構(gòu)１４３１逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＴｓｓＪＬＭ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋ｏｆ邋Ｔ６ＳＳ邋ｆｒｏｍ邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ．逡逑Ｔ６ＳＳ收縮的鞘由ＴｓｓＢ和ＴｓｓＣ兩個(gè)蛋白組成，這兩個(gè)蛋白在體外自發(fā)地形成以堆逡逑疊的齒輪為表象的管狀結(jié)構(gòu)［５Ｑ］。冷凍電子掃描技術(shù)表明鞘在胞內(nèi)組裝，垂直于膜，以中逡逑空的收縮形式或是細(xì)長的內(nèi)部致密形式存在。這個(gè)內(nèi)部致密結(jié)構(gòu)可能就是排出的Ｈｅｐ逡逑管［４６’５１］。在２０１５年，兩個(gè)＜４邋Ａ的高分辨率電子斷層掃描結(jié)構(gòu)表明ＴｓｓＢ和ＴｓｓＣ在原子逡逑層面的相互作用，呈現(xiàn)了一個(gè)六倍軸對稱的完整結(jié)構(gòu)［５２，５３］。這些結(jié)構(gòu)最顯著的特征是來逡逑自同一個(gè)螺旋的兩個(gè)ＴｓｓＣ分子相關(guān)的Ｐ折疊和來自鄰近螺旋ＴｓｓＢ形成的“握手結(jié)構(gòu)域”，逡逑這個(gè)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生交錯(cuò)的Ｐ片，Ｐ片可以提供收縮時(shí)保持結(jié)構(gòu)完整所需的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度（圖１．３）。逡逑目前，延長的鞘還未被發(fā)現(xiàn)，所以鞘收縮的精確機(jī)制還未知。然而，最近收縮前和逡逑收縮后都與（３片有類似結(jié)構(gòu)的Ｒ２農(nóng)菌素原子結(jié)構(gòu)的解析

Ｐｒｅｄａｔｏｒ邐＾邐Ｐｒｅｄａｔｏｒ邐＾逡逑圖２．２影響殺菌能力因素的篩選逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｔｈｅ邋ｆａｃｔｏｒ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｋｉｌｌｉｎｇ邋ａｂｉｌｉｔｙ邋ａｓｓａｙ邋ｗｅｒｅ邋ｓｃｒｅｅｎｅｄ．邋（Ａ－Ｄ）邋ＣＦＵ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｗｉｔｈ邋ＥＰＧＳ邋ｏｒ邋ＰＢＳ邋（Ｎｏｎｅ）邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ邋ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋（Ａ），邋ｔｉｍｅ邋（Ｂ），逡逑ｍｉｘｉｎｇ邋ｒａｔｉｏ邋（Ｃ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＮａＣｌ邋（Ｄ）邋ｗａｓ邋ｃｏｕｎｔｅｄ．逡逑出接合膜的范圍，影響菌落計(jì)數(shù)，所以后期實(shí)驗(yàn)選擇４邋ｈ。考察菌株混合比例，１：１和逡逑１０：１的殺菌能力均小于４：１邋（ＥＰＧＳ：邋ＭＣ４１００）（圖２．２Ｃ）。考察培養(yǎng)基，３％鹽濃度的培養(yǎng)逡逑基更適合溶藻弧菌殺菌（圖２．２Ｄ）。逡逑綜合以上結(jié)果，后期殺菌選擇的實(shí)驗(yàn)條件為３０°Ｃ、４邋ｈ孵育、菌株混合比例４：１和逡逑ＬＢＳ固體平板。在這種條件下，溶藻弧菌ＥＰＧＳ對大腸桿菌能造成？１０００倍的殺傷作用逡逑（Ｎｏｎｅ實(shí)驗(yàn)組和ＥＰＧＳ實(shí)驗(yàn)組４邋ｈ后大腸桿菌菌濃分別為？９．１３ｘｌ0９邋ＣＦＵ／ｍｌ和？４．９７ｘｌ0６逡逑ＣＦＵ／ｍｌ）（圖邋２．２）。逡逑雖然已經(jīng)找到溶藻弧菌ＥＰＧＳ最優(yōu)的殺菌條件，但自然環(huán)境中菌株會面對無機(jī)鹽種逡逑類多樣的情況。為了進(jìn)一步模擬溶藻弧菌所處的海水競爭環(huán)境，嘗試使用含有人工海水逡逑（ＡＳ）的２２１６Ｅ培養(yǎng)基代替普通的ＬＢＳ培養(yǎng)基進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

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本文編號：2800478