【摘要】：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種革蘭氏陰性短桿菌,該菌廣泛分布于淡水和海水中,能夠感染魚類、兩棲類、爬行類及人類,是一種重要的“人—獸—魚”共患的條件性致病病原菌。由該菌引發(fā)的細菌性敗血癥,已成為制約我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病。疫苗免疫是預(yù)防該病最為有效的措施。對于水產(chǎn)動物疫苗的免疫途徑,注射方式效果最好,但不適用于漁業(yè)生產(chǎn);浸浴免疫操作簡便,而皮膚保護屏障等限制了其推廣應(yīng)用。因此,尋求一種可用于規(guī)�；庖叩姆亲⑸涿庖叻绞�,使其達到注射免疫效果,成為漁用疫苗商業(yè)化的關(guān)鍵。碳納米管(Carbon nanotubes)作為一種納米載體具有較多的可修飾位點,并且極易穿透細胞和組織屏障,在生物分子轉(zhuǎn)運方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究以嗜水氣單胞菌氣溶素蛋白(aerA)作為疫苗設(shè)計靶點,通過原核重組和化學合成技術(shù)構(gòu)建碳納米管載亞單位疫苗系統(tǒng)。并以幼齡草魚為實驗對象,通過浸浴和注射方式對其進行免疫,結(jié)合攻毒試驗評價疫苗免疫保護效果。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.以嗜水氣單胞菌氣溶素基因為模板,通過原核重組技術(shù)構(gòu)建含原核表達質(zhì)粒pET32a-aerA的菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達獲得包涵體形式的重組蛋白(71.4 kDa),結(jié)合純化和復(fù)性處理,制備重組aerA亞單位疫苗。隨后經(jīng)縮合�；▽⒅亟MaerA亞單位疫苗與功能化修飾的單壁碳納米管進行連接,制備碳納米管載aerA蛋白疫苗系統(tǒng)(SWCNTs-aerA),BCA法測得該疫苗系統(tǒng)中aerA蛋白百分含量為41.6%。2.采用SWCNTs-aerA疫苗對幼齡草魚(1.0 g)分別進行浸浴和注射免疫,結(jié)合攻毒試驗評價疫苗免疫保護效果。結(jié)果顯示:在相同免疫濃度或劑量條件下,SWCNTs-aerA疫苗免疫與aer A疫苗免疫相比,抗體效價水平顯著提高(P0.05)。aerA疫苗浸浴和注射免疫最高濃度(50 mg/L)或劑量組(20μg/尾)的免疫保護率分別為47.4%和48.1%,而SWCNTs-aerA疫苗浸浴和注射免疫最高濃度或劑量組的免疫保護率分別為84.9%和79.6%。因此,SWCNTs能夠提高亞單位疫苗免疫保護率,通過浸浴免疫達到注射免疫保護效果。3.采用高通量測序技術(shù)對不同處理條件下草魚(對照組、疫苗免疫組和嗜水氣單胞菌感染組)腸道內(nèi)的微生物進行檢測,分析疫苗免疫對腸道微生物菌群的影響。結(jié)果顯示:對照組中氣單胞菌比例為10.43%,嗜水氣單胞菌攻毒后菌數(shù)明顯上升至19.48%;aerA疫苗免疫組氣單胞菌比例為6.21%,攻毒后菌數(shù)上升至6.92%;SWCNTs-aerA疫苗免疫組氣單胞菌比例為5.91%,攻毒后菌數(shù)為4.85%。aerA疫苗和SWCNTs-aerA疫苗能夠維持機體腸道內(nèi)氣單胞菌群組成比例的穩(wěn)定,有效抵抗嗜水氣單胞菌的侵染。綜上所述,單壁碳納米管載亞單位疫苗通過浸浴免疫的方式可以誘導(dǎo)幼齡草魚對嗜水氣單胞菌產(chǎn)生保護性免疫,為漁用疫苗的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S948
【圖文】：

圖 2-1 aerA 基因的 PCR 擴增結(jié)NA 標準 DL2000；1. aerA 的 PCR1 The PCR amplification product o Marker DL2000; 1. PCR amplific切膠純化回收后與pMD19-T菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將 PC錄的嗜水氣單胞菌 aerA 基。原核表達載體酶切和測序鑒2a-aerA 進行 BamH I 和 Hin5000 bp和1500 bp處各有一帶（1482 bp），符合預(yù)期結(jié)果 2-2 顯示。

圖 2-1 aerA 基因的 PCR 擴增結(jié) DNA 標準 DL2000；1. aerA 的 PCR.2-1 The PCR amplification product oNA Marker DL2000; 1. PCR amplific切膠純化回收后與pMD19-T搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將 PC收錄的嗜水氣單胞菌 aerA 基符。因原核表達載體酶切和測序鑒T32a-aerA 進行 BamH I 和 Hin于5000 bp和1500 bp處各有一條帶（1482 bp），符合預(yù)期結(jié)果圖 2-2 顯示。

嗜水氣單胞菌碳納米管載亞單位疫苗的研制及免疫效胞菌 aerA 蛋白的原核表達白的 SDS-PAGE 分析確的 pET32a-aerA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL2達，置于冰上超聲破碎裂解菌體，離心后收集析。結(jié)果如圖 2-3 所示，與未誘導(dǎo)的含 pET32a-aerA32a 空載體菌誘導(dǎo)前后的陰性對照相比，BL21（D量約為 70 kDa 的表達產(chǎn)物，上清部分基本無表達rA 蛋白主要以包涵體的形式存在。

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本文編號：2794293