【摘要】：低氧耐受和適應(yīng)調(diào)節(jié)能力對(duì)于水生動(dòng)物,尤其是移動(dòng)能力較差的物種,具有十分重要的意義。已有研究表明魁蚶(Scapharca broughtonii)具有較強(qiáng)的低氧耐受能力。本研究比較了7種海洋貝類在不同溶氧下的存活情況,并對(duì)溶解氧(dissolved oxygen,DO)為0.5 mg/L脅迫下不同時(shí)間的魁蚶5個(gè)組織進(jìn)行切片觀察;利用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)不同濃度溶氧脅迫的魁蚶血淋巴進(jìn)行測(cè)序,挖掘響應(yīng)低氧脅迫的差異表達(dá)基因和通路,并克隆獲得低氧誘導(dǎo)因子(HIF)信號(hào)通路中三個(gè)關(guān)鍵基因,分析了其基因結(jié)構(gòu)特征和低氧脅迫下的表達(dá)特征;應(yīng)用RNA干擾技術(shù),初步探究了魁蚶HIF信號(hào)通路中HIF-1α對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控作用。研究初步明確了魁蚶的耐低氧能力及其對(duì)低氧脅迫在組織及分子層面的響應(yīng),豐富了海洋貝類在該領(lǐng)域的相關(guān)研究?jī)?nèi)容。具體結(jié)果如下:(1)對(duì)比了魁蚶、毛蚶(Scapharca subcrenata)、青蛤(Cyclina sinensis)、江戶布目蛤(Protothaca jedoensis)、四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、麗文蛤(Meretrix Cusoria)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)等7種海洋貝類在DO為0.5 mg/L、2.5 mg/L和4.5 mg/L脅迫不同時(shí)間的生存狀態(tài)和死亡率,并計(jì)算半致死濃度。結(jié)果顯示:DO為0.5 mg/L實(shí)驗(yàn)組的死亡率顯著高于2.5 mg/L和4.5 mg/L實(shí)驗(yàn)組;0.5 mg/L脅迫4 h,實(shí)驗(yàn)組中毛蚶、青蛤和江戶布目蛤出現(xiàn)死亡,處理至120 h的死亡率分別達(dá)到55%±3.2%、48%±2.2%和45%±5.8%,顯著高于魁蚶、四角蛤蜊、麗文蛤、菲律賓蛤仔四組;脅迫9 d,魁蚶、四角蛤蜊、麗文蛤、菲律賓蛤仔、毛蚶、青蛤和江戶布目蛤的死亡率分別為44%±2.2%、48%±1.2%、65%±2%、68%±4.7%、74%±3.8%、88%±4.2%和100%。處理同一時(shí)間點(diǎn),魁蚶處理組的LC50明顯低于麗文蛤、菲律賓蛤仔、毛蚶、青蛤和江戶布目蛤這5個(gè)實(shí)驗(yàn)組;在處理3 d以前,魁蚶和四角蛤蜊LC50差異不顯著。低氧脅迫不同時(shí)間段魁蚶鰓、外套膜、斧足肝、胰腺和閉殼肌5個(gè)組織的組織切片觀察結(jié)果表明,DO為0.5mg/L脅迫120 h內(nèi),魁蚶的斧足和閉殼肌的肌肉組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化,而另外三個(gè)組織在120 h時(shí)可觀察到較為明顯的組織損傷。處理24 h,鰓絲結(jié)構(gòu)開(kāi)始發(fā)生變化,主要表現(xiàn)為鰓絲纖毛數(shù)量增多,鰓絲之間的接觸面積增加,鰓絲腔擴(kuò)張,鰓絲腔內(nèi)結(jié)締組織變薄,且腔體內(nèi)紅細(xì)胞比例增加,處理72 h開(kāi)始,紅細(xì)胞比例減少,白細(xì)胞比例增加,鰓絲腔開(kāi)始重新收縮;處理24 h,外套膜組織中的紅細(xì)胞比例顯著增加,白細(xì)胞比例減少,至72 h時(shí)開(kāi)始顯著降低,外套膜的結(jié)締組織開(kāi)始逐步出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象,120 h以后,外套膜的結(jié)締組織細(xì)胞融合加劇,結(jié)締組織出現(xiàn)疏松散亂。處理24 h,肝胰腺組織中的紅細(xì)胞比例開(kāi)始增加,出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象;72 h時(shí),紅細(xì)胞比例降低,細(xì)胞融合現(xiàn)象加劇,肝胰腺組織開(kāi)始變得松散。(2)三個(gè)魁蚶血淋巴RNA樣品的比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得185366條unigenes,其中NR庫(kù)中己獲得注釋的46,123 unigenes共比對(duì)上935個(gè)不同的物種。KEGG Pathway差異富集性分析結(jié)果顯示2040個(gè)差異基因共富集到153個(gè)Pathways,這些信號(hào)通路參與主要的代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-AKT signaling pathway)、碳代謝(Carbon metabolism)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)和HIF信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等免疫、代謝和細(xì)胞增殖等相關(guān)主要通路。選取10個(gè)差異基因采取熒光定量驗(yàn)證,結(jié)果顯示這些qRT-PCR驗(yàn)證的結(jié)果與mRNA測(cè)序結(jié)果雖然有些表現(xiàn)出倍數(shù)上的差異性,但是上下調(diào)趨勢(shì)是相同的,這一結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的準(zhǔn)確度。(3)以轉(zhuǎn)錄組獲得的片段為基礎(chǔ),結(jié)合RACE和qRT-PCR技術(shù)克隆獲得了魁蚶HIF-1α基因(SbHIF-1α,GenBank號(hào):MH936548)、HIF-1β基因(SbHIF-1β,GenBank:號(hào)MH936549)和ENO-1基因(SBENO-1,GenBank號(hào):MK575044)cDNA全長(zhǎng)序列,并研究了不同實(shí)驗(yàn)條件下mRNA表達(dá)特征。SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1基因cDNA全長(zhǎng)分別為2741 bp、3110 bp和2411 bp,三個(gè)ORF編碼711、717和603個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為80.8 kDa、78.4 kDa和66.5 kDa,理論等電點(diǎn)為5.57、6.63和5.29,預(yù)測(cè)含有兩個(gè)糖基化位點(diǎn),一個(gè)脯氨酸羥化酶結(jié)合位點(diǎn)LxxLAP;軟件預(yù)測(cè)SbHIF-1α和SbHIF-1β基因基因均包含一個(gè)HLH結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAC結(jié)構(gòu)域,SBENO-1基因含有一個(gè)Enolase-N結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Enolase-C結(jié)構(gòu)域。利用Mega 6.0軟件的Maximum likelihood模型構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示三個(gè)基因的分子進(jìn)化地位與其生物學(xué)分類地位大體保持一致。qRT-PCR檢測(cè)SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1基因在血淋巴、鰓、外套膜、斧足、閉殼肌和肝胰腺6個(gè)組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SbHIF-1α基因在六個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量由高到低分別是血淋巴、鰓、外套膜、斧足、閉殼肌和肝胰腺,血淋巴中表達(dá)量最高值是肝胰腺的11.63倍,差異達(dá)到極顯著水平(P0.01);SbHIF-1β基因的表達(dá)量由高到低順序是血淋巴、外套膜、鰓、肝胰腺、斧足和閉殼肌,相對(duì)于閉殼肌,SbHIF-1β在在血淋巴中表達(dá)量最高,是閉殼肌的12.16倍,達(dá)到極顯著水平的差異(P0.01);SBENO-1基因組織表達(dá)高低順序是鰓、血淋巴、肝胰腺、外套膜、閉殼肌和斧足,最高值是最低值的14.23倍,也達(dá)到極顯著差異(P0.01)。三個(gè)基因在DO為0.5 mg/L、2.5 mg/L、4.5 mg/L的低氧脅迫下的六個(gè)組織中的表達(dá)特征:三個(gè)基因在0.5 mg/L實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性高于2.5mg/L和4.5 mg/L實(shí)驗(yàn)組,且在每個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量在一定處理時(shí)間后顯著高于對(duì)照組,其中血淋巴和鰓比其他四個(gè)組織的表達(dá)量差異更顯著。血淋巴中SbHIF-1α的表達(dá)量變化趨勢(shì)是逐步升高,而其他五個(gè)組織的表達(dá)變化趨勢(shì)是先升高再降低再升高的趨勢(shì),血淋巴中,DO為0.5 mg/L脅迫4 h后,SbHIF-1α的表達(dá)量較對(duì)照組即達(dá)到極顯著差異(P0.01),脅迫64 h后,表達(dá)量達(dá)到最高,是對(duì)照組的519.43倍。低氧脅迫0.5 mg/L和2.5 mg/L處理組SbHIF-1β的變化趨勢(shì)更明顯,SbHIF-1β的表達(dá)量變化趨勢(shì)是先降低再升高,在8 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組達(dá)到極顯著差異水平,36 h時(shí)變化量達(dá)到最大值,隨后降低,顯著水平都達(dá)到極顯著水平(P0.01),整體來(lái)看,鰓、血淋巴和肝胰腺中SbHIF-1β相比其他組織表達(dá)量更顯著,最低值時(shí),對(duì)照組分別為其24倍和19.43倍。血淋巴中SBENO-1相比其他組織響應(yīng)較為積極,表達(dá)量顯著高于其他組織,最高值為對(duì)照組的89.25倍,表達(dá)量隨脅迫時(shí)間增加而總體趨勢(shì)是先升高,在24 h后有逐步下調(diào)的趨勢(shì),鰓中SBENO-1的表達(dá)量趨勢(shì)與血淋巴相似,而SBENO-1這種升高后降低再升高的變化趨勢(shì)也體現(xiàn)斧足、閉殼肌和肝胰腺中,0.5 mg/L實(shí)驗(yàn)組斧足、閉殼肌和肝胰腺中SBENO-1的最大值分別是對(duì)照組的6.98、32.31和12.69倍,都達(dá)到極顯著水平(P0.01)。本研究明確了SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1的基因結(jié)構(gòu)特征、時(shí)空表達(dá)特征及對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)規(guī)律,豐富了海洋貝類HIF通路基因的研究資料。(4)對(duì)魁蚶HIF-1α基因進(jìn)行dsRNA干擾,檢測(cè)干擾后SbHIF-1α及其靶基因一氧化氮合酶(NOS)、運(yùn)鐵蛋白(TF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血紅素氧合酶(Ho)和烯醇酶(ENO)基因各時(shí)相的表達(dá)情況。結(jié)果表明,SBHIF-1α基因在干擾24 h開(kāi)始降低,在48-72 h,SBHIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P0.05);降低一直持續(xù)到96 h,之后基因表達(dá)量開(kāi)始回調(diào)。在SBHIF-1α被抑制表達(dá)后,SBHIF-1β基因在48 h-72 h顯著上調(diào)表達(dá)(P0.05),表明HIF兩個(gè)亞基基因的表達(dá)可能有相互抑制的調(diào)節(jié)作用;相比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組中各靶基因的表達(dá)量,在SBHIF-1α被干擾48 h-96 h后出現(xiàn)了顯著性下調(diào)(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 0.5mg/L 濃度溶氧下，7 種貝類不同時(shí)間段死亡率統(tǒng)計(jì)Fig 1-1 Statistics on the death of 7 kinds of shellfish in different time periods at the concentration of0.5 mg/ L dissolved oxygen

圖 1-2 2.5mg/L 濃度溶氧下，7 種貝類不同時(shí)間段死亡情況統(tǒng)計(jì)Fig 1-2 Statistics on the death of 7 kinds of shellfish in different time periods at the concentration of2.5 mg/ L dissolved oxygen

圖 1-2 2.5mg/L 濃度溶氧下，7 種貝類不同時(shí)間段死亡情況統(tǒng)計(jì)Fig 1-2 Statistics on the death of 7 kinds of shellfish in different time periods at the concentration of2.5 mg/ L dissolved oxygen

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