【摘要】：紅白錦鯉(Cyprinus carpio var.Koi)是鯉魚(Cyprinus carpio)經(jīng)人工選育出的變種之一,是一種名貴的觀賞魚。其體表黑色素細胞缺失,體色以白色為基礎(chǔ),同時伴有紅色的斑塊。其體表的皮膚和鱗片中分布的紅色素細胞(顯紅色)和虹彩細胞(顯白色)是決定其紅白體色的主要因素,因此紅白錦鯉是一種用于紅白體色研究的理想材料。為了探究錦鯉中紅色體色和白色體色的遺傳機制,我們選取了紅白錦鯉兩種顏色的皮膚和鱗片,利用RNA-seq方法對其進行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。皮膚和鱗片兩個組織間的差異基因分析表明皮膚和鱗片中表達的基因數(shù)分別為30005,30384;通過表達量值的比較,發(fā)現(xiàn)皮膚和鱗片基因的整體表達水平具有顯著差異,鱗片中的表達量高于皮膚。皮膚和鱗片中各找到4042,3787個上調(diào)基因,通過富集分析發(fā)現(xiàn)兩個組織中的上調(diào)基因富集的GO Term有顯著差異,GO富集顯示鱗片中上調(diào)基因顯著的富集到免疫相關(guān)的生物學(xué)過程和鱗片的發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程,關(guān)于鱗片的免疫功能還是極少有報道。皮膚中上調(diào)基因顯著的富集到與皮膚及附屬物的形態(tài)發(fā)生,免疫調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)過程,這些富集的生物學(xué)過程都是與皮膚特定的功能相適應(yīng)的。比較紅鱗和白鱗的差異基因的GO富集分析結(jié)果,紅鱗中的223個上調(diào)基因顯著的富集到神經(jīng)細胞分化,視黃酸代謝,色素細胞調(diào)控和性別決定等生物學(xué)過程。神經(jīng)細胞分化,視黃酸代謝和色素細胞的調(diào)控,這些結(jié)果為色素細胞起源于神經(jīng)鞘細胞的學(xué)說提供了有力的支持。在很多性別二態(tài)性的魚類中,在繁殖季節(jié)兩種性別的體色有明顯的差異,如溠湉、馬口、太平洋鮭等;一般雄魚的體色表現(xiàn)得艷麗,雌魚的體色則不太顯眼。至于這些性別決定基因是如何控制體色的還有待深入的探究。白鱗中195個上調(diào)基因顯著的富集到生長調(diào)控,細胞遷移和肌細胞功能相關(guān)的生物學(xué)過程,這些結(jié)果說明紅色素細胞和虹彩細胞可能具有不同遷移能力。結(jié)合之前的錦鯉紅皮和白皮的差異基因分析結(jié)果,通過對紅鱗和紅皮中一致性的GO Term進行分析,發(fā)現(xiàn)相同顏色的兩個不同組織中一致的生物學(xué)過程是“脂肪儲存(lipid storage)”和“脂肪代謝(regulation of lipid catabolic process)”。這可能是因為類胡蘿卜素屬脂溶性色素,脂肪的儲存與代謝有利于類胡蘿卜素的吸收與代謝。白皮中的上調(diào)基因和白鱗中的上調(diào)基因一致性的富集結(jié)果中,最顯著富集的生物學(xué)過程是橫紋肌發(fā)育,這表明虹彩細胞中載色體晶體可能具有較強的活動能力。比較紅皮和白皮,紅鱗和白鱗的差異基因,篩選出22個在皮膚和鱗片具有相同表達模式的基因,其中包含視黃酸代謝相關(guān)基因(cyp2ae1,box1,opsin5),轉(zhuǎn)運蛋白(slc2a11b,bscl2和tmem130),以及神經(jīng)細胞特異性表達的基因(syt11b和nell2b)。β胡蘿卜素加氧酶(box1)是將β-β胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成視黃醛分子的關(guān)鍵酶,box1基因在紅皮和紅鱗中均為特異性表達的基因。opsin5屬于視蛋白基因家族,通過與視黃醛集合成視紫紅質(zhì),不論是在有視覺動物和還是無視覺動物中都是感光分子。同時利用現(xiàn)有的鯉魚Pacbio全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),采用ISO-Analysis全長轉(zhuǎn)錄組分析軟件共獲得113418條全長轉(zhuǎn)錄本。在篩選出的22個體色相關(guān)的候選基因基因中,共檢測到10個基因的全長轉(zhuǎn)錄本。除此外,還開發(fā)了一款Pacbio全長轉(zhuǎn)錄組分析軟件ISO-Analysis,ISO-Analysis能夠利用Pacbio下機數(shù)據(jù)得到一致性序列,對一致性序列進行分類,還能實現(xiàn)基因注釋,基因和轉(zhuǎn)錄本水平的定量分析。對比當前廣泛使用的全長轉(zhuǎn)錄本分析軟件SMRT-link,ISO-Analysis具有更高的去接頭效果,能夠獲得更多的全長轉(zhuǎn)錄本,有效提升了數(shù)據(jù)的利用率。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

白色鱗片(圖 2-1 c)以下簡稱白鱗，紅色皮膚(圖2-1 d)以下簡稱紅皮和白色皮膚(圖 2-1 e)以下簡稱白皮 4 種組織。取皮膚時用解剖刀剝離粘附在真皮層的肌肉以避免組織的污染，取鱗片時僅取頂部區(qū)域的部分。然后將不同樣本的相同組織進行混合，混合后的組織用于總 RNA 的提取。2.1.2 總 RNA 提取將上述采集到的 20 條魚的 4 種組織使用 Trizol Reagent 試劑進行總 RNA 提取。具體操作步驟如下：取 1.5mL 的無 RNA 酶的離心管，加入 1mL Trizol Reagent。取約 0.5g 組織組織放入經(jīng)過 180℃高溫烘烤滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨成粉末。取約 50mg 的充分研磨后的組織加入到已經(jīng)加入 Trizol 的 1.5ml 離心管中，劇烈震蕩 15s。多余經(jīng)研磨后的組織放入離心管中-80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ尤?Trizol 和組織粉末的離心管中加入 200μL 氯仿，震蕩混勻 30s，然后室溫靜置 5min；4℃下以 12000g 離心力離心 15min；小心吸取離心管中的上清液(約500uL)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μ（L-20℃預(yù)冷）異丙醇

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 測序飽和度評估了確保測序數(shù)據(jù)量能夠準確的評估轉(zhuǎn)錄本的表達量，在進行定量分析分析之前，使用 RSeQC 軟件[83]采用重新抽樣的方法來評估測序飽和度測序數(shù)據(jù)重新抽樣生成 20 個子集，通過 RSeQC 來評估每個子集的中基當基因表達量不隨測序數(shù)據(jù)量增加而增加時，就認為測序深度達到飽效的覆蓋大部分基因并準確評估其表達量。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文兩個組織中所有基因整體表達水平接近(圖 2-1 a)。但在富集的 GO Term 上有明顯的差異，分別對皮膚和鱗片兩個組織中激活表達的基因進行 GO 富集分析，第四層 GO Term 的卡方檢驗的結(jié)果顯示有 108 個是過表達或低表達的(圖 2-3 b, Chisquare test p value < 0.05)，這表明皮膚和鱗片之間的基因表達存在顯著差異。

【參考文獻】

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本文編號：2767298