【摘要】：本實(shí)驗(yàn)以不同食性海水養(yǎng)殖魚類——羅非魚(Oreochromis niloticus)、卵形鯧湽(Trachinotus ovatus)和軍曹魚(Rachycentron canadum)為研究對(duì)象,初始體重分別為(31.5±0.29)g、(85.17±1.89)g和(23.33±0.29)g。以糊精為飼料糖源,共設(shè)置6個(gè)處理組,分低(LD,20%、13%和12%)、中(MD,30%、26%和24%)、高(HD,40%、39%和36%)不同添加水平,以及持續(xù)饑餓(S)、饑餓再投喂(R,饑餓4周+投喂4周,投喂MD組飼料)、持續(xù)投喂(C,投喂MD組飼料)不同營養(yǎng)狀態(tài)組,高低水平依次設(shè)置等氮等能(羅非魚:粗蛋白35%、總能13.8KJ;卵形鯧湽:粗蛋白42%、總能16.0KJ;軍曹魚:粗蛋白45%、總能16.9KJ)。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)魚20尾,養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8W。采用RACE-PCR技術(shù)克隆研究這三種魚糖代謝關(guān)鍵酶GK、PK和PEPCK在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的區(qū)別;比較分析不同食性海水養(yǎng)殖魚類在不同飼料糖水平和營養(yǎng)狀態(tài)下GK、PK和PEPCK基因表達(dá)量的變化及其酶活性的變化。研究結(jié)果如下:1、三種不同食性魚類糖代謝關(guān)鍵酶GK、PK和PEPCK的基因克隆和序列分析成功克隆了卵形鯧湽的GK、PK(登錄號(hào):KM262819)和PEPCK(KJ438292),以及軍曹魚的GK和PK(KM262818)基因的全長c DNA序列。五條基因的ORF:卵形鯧湽的GK基因ORF為1437 bp;卵形鯧湽PK基因ORF為1593 bp;卵形鯧湽的PEPCK基因ORF為1875 bp;軍曹魚GK基因核心片段1356 bp;軍曹魚的PK基因ORF為1599 bp。結(jié)果表明三種不同食性魚類GK、PK和PEPCK基因同源性和進(jìn)化關(guān)系與食性相關(guān),食性相近的物種相似度更高,進(jìn)化關(guān)系更近。2、飼料糖水平和營養(yǎng)狀態(tài)對(duì)不同食性魚類肝臟GK基因表達(dá)和活性的影響不同飼料糖水平下,三種不同食性魚類肝臟GK的表達(dá)量均隨飼料糖水平的上升而顯著升高(P0.05),三種魚GK活性整體呈現(xiàn)差異不顯著(P0.05)。同飼料糖水平下,軍曹魚的GK m RNA表達(dá)水平顯著高于卵形鯧湽和羅非魚,而在同一水平HD組,GK活性變化表明雜食性羅非魚高于溫和肉食性卵形鯧湽,卵形鯧湽高于兇猛肉食性軍曹魚。不同營養(yǎng)狀態(tài)下,三種不同食性海水魚肝臟GK的表達(dá)量均為S組與R組顯著低于C組(P0.05);在相同營養(yǎng)狀態(tài)下,雜食性羅非魚和溫和肉食性卵形鯧湽S和R組GK m RNA高于兇猛肉食性軍曹魚;而C組GK表達(dá)量軍曹魚的顯著高于羅非魚和卵形鯧湽(P0.05),同時(shí)C組軍曹魚GK活性增加,顯著高于卵形鯧湽(P0.05),而稍低于羅非魚,整體趨勢同GK基因表達(dá)量的變化。3、飼料糖水平和營養(yǎng)狀態(tài)對(duì)不同食性魚類肝臟PK的基因表達(dá)和活性的影響不同飼料糖水平下,三種魚類肝臟中PK表達(dá)量均隨飼料糖水平增加而顯著上升(P0.05),PK活性升高不顯著(P0.05);相同糖水平下,三個(gè)處理組羅非魚PK表達(dá)量均顯著高于卵形鯧湽和軍曹魚(P0.05),兩種肉食性魚類PK表達(dá)量之間無顯著差異(P0.05),PK活性在LD組和MD組中,羅非魚和卵形鯧湽顯著高于兇猛肉食性軍曹魚(P0.05)。不同營養(yǎng)狀態(tài)下,三種魚類肝臟PK的表達(dá)量在R組和C組均顯著高于S組(P0.05),而PK活性在S組和R組無顯著差異(P0.05),軍曹魚PK活性在C組顯著降低(P0.05)。相同營養(yǎng)狀態(tài)下,兇猛肉食性軍曹魚S和R組PK m RNA水平顯著高于溫和肉食性卵形鯧湽(P0.05),而與雜食性羅非魚差異不明顯(P0.05),在C組中,卵形鯧湽和軍曹魚PK表達(dá)量持平,兩者均顯著低于羅非魚(P0.05)。S和R組PK活性均表現(xiàn)為兇猛肉食性軍曹魚顯著低于羅非魚和卵形鯧湽(P0.05),而羅非魚和卵形鯧湽則無差異(P0.05)。卵形鯧湽C組PK活性顯著高于羅非魚,羅非魚顯著高于軍曹魚(P0.05)。4、飼料糖水平和營養(yǎng)狀態(tài)對(duì)不同食性魚類肝臟PEPCK的基因表達(dá)和活性的影響隨著飼料糖含量的升高,三種不同食性魚類肝臟PEPCK表達(dá)量呈顯著性降低(P0.05),PEPCK酶活性也表現(xiàn)出降低的趨勢。同一飼料糖水平下,軍曹魚PEPCK基因表達(dá)量高于卵形鯧湽,卵形鯧湽高于羅非魚,而PEPCK活性在羅非魚中顯著高于軍曹魚,而與卵形鯧湽無顯著差異(P0.05)。不同營養(yǎng)狀態(tài)下,三種不同食性魚類S組肝臟PEPCK表達(dá)量均顯著高于R組,R組顯著高于C組(P0.05);PEPCK活性在軍曹魚中無顯著差異(P0.05),在卵形鯧湽中僅S組顯著高于C組,羅非魚S組PEPCK活性顯著高于R組,R組又顯著高于C組(P0.05)。在相同的營養(yǎng)狀態(tài)下,兇猛肉食性軍曹魚S、R和C組PEPCK表達(dá)量顯著高于卵形鯧湽和羅非魚(P0.05);S、R和C組PEPCK活性均表現(xiàn)為雜食性羅非魚的高于卵形鯧湽,卵形鯧湽顯著高于兇猛肉食性軍曹魚(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

糖酵解及糖異生的基本過程

圖 2-1 質(zhì)粒 pMD19-T Vector 的物理圖譜Fig.2-1 Physical map of pMD19-T Vector2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備(1) 無菌操作臺(tái)（VD-650）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；(2) 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Sigma，eppendorf 公司；(3) 凝膠成像儀：美國 Biorad 公司；(4) 梯度 PCR 儀（T100 Thermal Cycler PCR 儀）：美國 Bio-rad 公司；(5) 恒壓恒流電泳儀：Bio-Rad 公司；(6) 電子天平（MP4002）：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；(7) 恒溫水浴鍋（DK-S24）：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；(8) 超純水制備儀（Milli-Q）：廣東丹利科技有限公司；(9) 紫外分光光度計(jì)（Pharmacia GENEQUANT II）：德國 Eppdorf 公司；(10) 超低溫冰箱（-80℃）：美國 Thermo 公司、冰箱（-20℃/4℃）：Haier 公司(11) 移液槍：德國 Eppendorf 公司；(12) 立式壓力蒸汽滅菌鍋（LS-B35L-11）：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；

不同食性魚類糖代謝關(guān)鍵酶基因克隆及表達(dá)比較研究（9）挑取白色單一菌落置于 LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培2~3 h。2.2.1.7 陽性菌落 PCR 鑒定與測序（1）將上述轉(zhuǎn)化好的菌液進(jìn)行 PCR 鑒定，反應(yīng)體系同 2.2.1.3 和 2.2.1.4。（2）篩選出 PCR 克隆的陽性菌，寄樣至廣州 Invitrogen 公司測序部測序。（3）將測序結(jié)果利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行目的基因的生物信息學(xué)分析。2.2.6 軍曹魚 GK、PK 基因的 RACE 克隆方法步驟同上述卵形鯧湽 GK、PK 的克隆方法。2.3 結(jié)果和分析2.3.1 總 RNA 分離從卵形鯧湽和軍曹魚的肝臟中提取的總 RNA，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可清晰的 18S 和 28S 2 條帶，表明總 RNA 完整性良好，且無基因組 DNA 污染（圖 2-經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定表明 OD260/OD280處于 1.9 至 2.0 之間，滿足克隆基因的要求

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2748370