【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在我國是重要的淡水養(yǎng)殖蝦類,具有重要經(jīng)濟(jì)價值。隨著水體環(huán)境惡化和高密度養(yǎng)殖方法的廣泛使用,使得淡水蝦類病害頻繁爆發(fā),每年都會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。日本沼蝦作為淡水蝦類的代表,對其免疫系統(tǒng)尤其是抗菌免疫的分子機(jī)制進(jìn)行研究具有十分重要的意義。SVWC(Single domain von Willebrand factor type C)蛋白家族是在無脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的含有8個保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)的小分子蛋白家族。有研究表明,SVWC蛋白對機(jī)體應(yīng)對環(huán)境刺激、營養(yǎng)狀態(tài)變化、病毒感染以及細(xì)菌刺激具有重要的作用。但之前關(guān)于SVWC蛋白的研究主要集中在SVWC幫助機(jī)體抵抗病毒感染,對SVWC參與機(jī)體的抗菌免疫功能方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)合日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出一條SVWC基因,將其命名為MnSVWC,對MnSVWC參與日本沼蝦抗菌免疫功能進(jìn)行研究。研究成果如下:1、利用qPCR方法對MnSVWC mRNA的組織分布及維氏氣單胞菌刺激下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,MnSVWC在日本沼蝦的鰓組織和血細(xì)胞中表達(dá)量最高,且受維氏氣單胞菌刺激后表達(dá)顯著上調(diào)。2、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功對MnSVWC進(jìn)行了重組表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物rMnSVWC進(jìn)行了純化。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),rMnSVWC在鈣離子存在的情況下使大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及維氏氣單胞菌(Aeromonas virginia)發(fā)生凝集反應(yīng);利用Western blot方法證實(shí)rMnSVWC可以和這4種細(xì)菌發(fā)生結(jié)合;體外溶菌實(shí)驗(yàn)和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)rMnSVWC不存在直接殺菌活性。3、將細(xì)菌與rMnSVWC共孵育后注射到日本沼蝦體內(nèi),檢測發(fā)現(xiàn)rMnSVWC可以明顯促進(jìn)沼蝦對細(xì)菌的清除能力;RNAi敲低MnSVWC的表達(dá)后,日本沼蝦對細(xì)菌的清除能力顯著下降。4、利用免疫熒光技術(shù)并結(jié)合共聚焦顯微鏡,我們發(fā)現(xiàn)rMnSVWC能結(jié)合于日本沼蝦血細(xì)胞表面,并促進(jìn)血細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1 無脊椎動物先天免疫防御機(jī)制(Rowley et al., 2007)Fig1 Innate immune defense mechanism in invertebrates (Rowley et al., 2007)SVWC 蛋白家族簡介 SVWC 家族蛋白結(jié)構(gòu)

圖 3.1 MnSVWC cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列G：起始密碼子；TAG：終止密碼子；下劃線：信號肽；灰色陰影：成熟肽；C：8 個保守的半氨酸。Fig 3.1 MnSVWC cDNA sequence and its encoded amino acid sequenceATG: initiation codon; TAG: stop codon; Underline: signal peptide; Gray shade: mature peptide; C: 8conserved cysteines.

圖 3.2 MnSVWC 結(jié)構(gòu)域預(yù)測（A）及氨基酸組成（B）Fig3.2 MnSVWC domain prediction (A) and amino acid composition (B)了后續(xù)研究日本沼蝦 MnSVWC 蛋白功能做鋪墊，我們將 MnSVWC 與不同 SVWC 蛋白進(jìn)行序列比對分析。通過 NCBI 查找到現(xiàn)有甲殼綱中已發(fā)現(xiàn)的 SV

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本文編號：2743895