【摘要】：傳染性胰臟壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)是引起傳染性胰臟壞死病(Infectious Pancreatic Necrosis,IPN)的病原體。IPNV具有高度傳染性,死亡率高達90%,幸存的魚終生攜帶病毒。隨著我國鮭鱒魚類養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大,該病也日趨嚴重,而國內(nèi)尚無及時有效的防治IPNV的藥物。因此,對水產(chǎn)品進行病原監(jiān)測是控制該病傳播的首選方法。病原的免疫學(xué)檢測手段具有耗時長、靈敏度低、特異性差等缺點;分子生物學(xué)檢測方法則需要昂貴的儀器,檢測效果只能通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是等溫核酸擴增技術(shù),在恒溫條件下反應(yīng)可在體外進1小時內(nèi)完成。除了瓊脂糖凝膠電泳檢測外,LAMP檢測結(jié)果還可以通過SYBR Green I熒光試劑染色后直接進行肉眼觀察,適用于大規(guī)�，F(xiàn)場檢測。本試驗針對國內(nèi)現(xiàn)行的IPNV ChRtm213建立RT-LAMP檢測手段。本試驗以實驗室分離保存的IPNV ChRtm213(Genbank收錄號KX23491和KX23490)全基因組為靶基因,利用Primer Explorer V5引物設(shè)計軟件設(shè)計4套引物,嚴格按照引物設(shè)計原則及注意事項進行引物篩選,比較4套引物擴增效率得到最佳引物組合。使用最佳引物對提取IPNV(Jasper)RNA進行RT-LAMP反應(yīng),并對試驗反應(yīng)條件進行優(yōu)化。對已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系進行靈敏度試驗、特異性試驗以及臨床初步應(yīng)用試驗。結(jié)果顯示:引物B2擴增效果略優(yōu)于其他三組,選擇引物B2作為RT-LAMP反應(yīng)的引物組。當(dāng)Mg~(2+)終濃度為4 mmol/L~8mmol/L時、dNTPs終濃度為0.5 mmol/L~1.5 mmol/L、甜菜堿終濃度為0.0 mol/L~1.2mmol/L時,RT-LAMP反應(yīng)體系檢測效果最佳。反應(yīng)在63℃的擴增產(chǎn)率優(yōu)于65℃、67℃,體系在60 min即可完成反應(yīng)。此方法不與傳染性造血器官壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)及病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)發(fā)生交叉反應(yīng);此方法相對比國外已發(fā)表的IPNV(Sp)RT-LAMP檢測方法更適用于IPNV(Jasper)檢測,其檢測限為0.0008 fg/25μL。應(yīng)用本試驗所建立IPNV RT-LAMP檢測方法進行臨床初步應(yīng)用,不同區(qū)域的7個肝臟和腎臟樣本進行檢測,凝膠電泳檢測結(jié)果和顏色檢測結(jié)果相一致。綜上所述,本試驗針對于國內(nèi)流行IPNV血清型Jasper,所建立IPNV RT-LAMP方法。此方法的特異性良好、靈敏性高、比國外已發(fā)表的IPNV(Sp)RT-LAMP的檢測技術(shù)更適用于檢測國內(nèi)流行株IPNV(Jasper),可通過顏色變化(陽性樣本為熒光綠色,陰性樣本為紅棕色)來判定核酸變化的結(jié)果。本實驗針對國內(nèi)現(xiàn)行IPNV建立的RT-LAMP方法,具有特異性好、靈敏性強、檢測結(jié)果可以通過肉眼觀察直接判斷等特點,且在實際應(yīng)用中效果準確率高,為我國IPNV基層快速檢測以及大規(guī)模檢測提供支持。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S941.415
【圖文】：

IPNV 在美洲、歐洲、以及亞洲的日本都相IPN 相繼在我國的甘肅[6]、山東[7]、山西[8]等地爆發(fā)。隨出現(xiàn)了 IPN，病毒感染導(dǎo)致流行區(qū)域的虹鱒魚出現(xiàn)大規(guī)模發(fā)地之一[9]。而上世紀的 80 年代到 90 年代，我國分離的R-299[12]。近幾年，我國科學(xué)家從四川和云南各分離一株N 的高發(fā)季，一般水溫處于 10~15℃時，發(fā)病率最高，魚方式傳播：一種是水平傳播，這種方式是經(jīng)由漁具、水播病毒；另一種則是垂直傳播，經(jīng)由無癥狀攜帶病毒的魚垂直傳播給后代。IPNV 可導(dǎo)致 14~70 天的幼魚的死亡率帶病毒，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅[15]。觸性和急性傳染病，感染后的鮭鱒魚其特征為肝臟和腎主要病癥表現(xiàn)：游動異常、通體發(fā)黑、眼球突出、肛門壓時可從肛門射出、食欲不振、腹鰭基部出現(xiàn)充血等癥腫大、胰腺出現(xiàn)壞死、腸道有粘液滲出、腹腔有腹水。在有許多出血點，肝臟和胰腺的細胞核固縮，出現(xiàn)空泡，并壞死。

Polymerase），啟動自動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，特異地擴增目的基因；此技術(shù)對于靶序列上 6 個各異的特異區(qū)域，設(shè)計 4 條特異性引物進行擴增，可在 1 h 內(nèi)擴增出的靶序列拷貝數(shù)約為109~1010倍，具有高時效性[87]。LAMP 技術(shù)的擴增模板只能是 DNA，若擴增模板為 RNA 則必須在進行 LAMP 擴增之前利用一定濃度的反轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，實現(xiàn)對 RN模板的直接擴增，從而形成了 RT-LAMP 技術(shù)，這種改進使得 LAMP 技術(shù)在檢測試驗中有更多可能性[88]。1.3.2 LAMP 引物設(shè)計1.3.2.1 LAMP 引物設(shè)計原理引物的特異性是 LAMP 實驗的決定性因素。LAMP 技術(shù)擴增基因的關(guān)鍵是設(shè)計四種特異性引物，并從待擴增的靶序列中選擇六個特定區(qū)域。六個特定區(qū)域是 3’端的 F3c、F2和 F1c 以及 5’端的 B1、B2、B3；3’端的 F3c、F2c 和 F1c 區(qū)和 5’端的 B1、B2 和 B區(qū)；對應(yīng)互補鏈的區(qū)位為 5’端的 F3、F2 和 F1 區(qū)以及 3’端的 B3c、B2c 和 B1c 區(qū)（圖 2）。Mori Y[89]設(shè)計一對環(huán)引物以添加到 LAMP 引物中，添加環(huán)引物使得引物擴增的時效性高，但是在引物設(shè)計和篩選中它將變得更嚴格。上游內(nèi)環(huán)引物的 Loop F 設(shè)計區(qū)位于 F1c 區(qū)和 F2c 區(qū)間，下游內(nèi)環(huán)引物的 Loop B 設(shè)計區(qū)位于 B1c 區(qū)和 B2c 區(qū)之間。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陸冰洋;劉華棟;李婷婷;唐娟;丁樹榮;王彩先;詹麗娥;;傳染性法氏囊病病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2018年15期

2 公政;王瑩;;西瓜花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年12期

3 徐穎;徐亞飛;劉永豐;邱志君;鄭煒;;玉米褪綠斑駁病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2017年01期

4 單長林;周圓;李孝軍;楊賽軍;邵煒冬;;RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應(yīng)用[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年07期

5 徐穎;;小麥線條花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立（英文）[J];Agricultural Science & Technology;2014年11期

6 楊卓;于漢勛;李巍;;小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測和鑒別方法的建立[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2015年09期

7 張韶華;崔侖標;祁賢;付建光;謝國祥;張洪英;;RT-LAMP法對Ⅱ型諾如病毒的檢測[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年15期

8 丁小蘭;趙竹;馬占鴻;張永江;何增磊;李明福;;馬鈴薯帚頂病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];植物檢疫;2014年05期

9 劉淼;徐黎明;盧彤巖;趙景壯;曹永生;劉紅柏;尹家勝;張金鳳;馮劍;;魚類傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2014年05期

10 樊粉霞;闞飆;閆梅英;;利用RT-LAMP技術(shù)鑒別傷寒沙門菌[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2013年07期

相關(guān)會議論文 前10條

1 曾小娜;劉中勇;朱道中;房紅瑩;蔣啟榮;羅滿林;劉鎮(zhèn)明;;豬瘟病毒RT-LAMP實驗診斷初報[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

2 李偉;李剛;范曉娟;張坤;賈風(fēng)琴;史利軍;Hermann Unger;;小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

3 周生;唐夢君;戴亞斌;劉梅;程旭;呂曉娟;;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)檢測傳染性支氣管炎病毒[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 董嘉文;孫敏華;尚毅;胡奇林;;禽呼腸孤病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

5 彭宜;謝芝勛;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;謝麗基;范晴;羅思思;;禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術(shù)的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會論文集[C];2012年

6 劉中勇;曾小娜;朱道中;房紅瑩;蔣啟榮;吳志強;羅滿林;;豬瘟病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

7 黃元;向華;陳晶;向蓉;張健

本文編號：2741714