【摘要】：傳染性胰臟壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)是引起傳染性胰臟壞死病(Infectious Pancreatic Necrosis,IPN)的病原體。IPNV具有高度傳染性,死亡率高達90%,幸存的魚終生攜帶病毒。隨著我國鮭鱒魚類養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大,該病也日趨嚴重,而國內(nèi)尚無及時有效的防治IPNV的藥物。因此,對水產(chǎn)品進行病原監(jiān)測是控制該病傳播的首選方法。病原的免疫學檢測手段具有耗時長、靈敏度低、特異性差等缺點;分子生物學檢測方法則需要昂貴的儀器,檢測效果只能通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷。環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是等溫核酸擴增技術,在恒溫條件下反應可在體外進1小時內(nèi)完成。除了瓊脂糖凝膠電泳檢測外,LAMP檢測結果還可以通過SYBR Green I熒光試劑染色后直接進行肉眼觀察,適用于大規(guī)�，F(xiàn)場檢測。本試驗針對國內(nèi)現(xiàn)行的IPNV ChRtm213建立RT-LAMP檢測手段。本試驗以實驗室分離保存的IPNV ChRtm213(Genbank收錄號KX23491和KX23490)全基因組為靶基因,利用Primer Explorer V5引物設計軟件設計4套引物,嚴格按照引物設計原則及注意事項進行引物篩選,比較4套引物擴增效率得到最佳引物組合。使用最佳引物對提取IPNV(Jasper)RNA進行RT-LAMP反應,并對試驗反應條件進行優(yōu)化。對已經(jīng)優(yōu)化的反應體系進行靈敏度試驗、特異性試驗以及臨床初步應用試驗。結果顯示:引物B2擴增效果略優(yōu)于其他三組,選擇引物B2作為RT-LAMP反應的引物組。當Mg~(2+)終濃度為4 mmol/L~8mmol/L時、dNTPs終濃度為0.5 mmol/L~1.5 mmol/L、甜菜堿終濃度為0.0 mol/L~1.2mmol/L時,RT-LAMP反應體系檢測效果最佳。反應在63℃的擴增產(chǎn)率優(yōu)于65℃、67℃,體系在60 min即可完成反應。此方法不與傳染性造血器官壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)及病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)發(fā)生交叉反應;此方法相對比國外已發(fā)表的IPNV(Sp)RT-LAMP檢測方法更適用于IPNV(Jasper)檢測,其檢測限為0.0008 fg/25μL。應用本試驗所建立IPNV RT-LAMP檢測方法進行臨床初步應用,不同區(qū)域的7個肝臟和腎臟樣本進行檢測,凝膠電泳檢測結果和顏色檢測結果相一致。綜上所述,本試驗針對于國內(nèi)流行IPNV血清型Jasper,所建立IPNV RT-LAMP方法。此方法的特異性良好、靈敏性高、比國外已發(fā)表的IPNV(Sp)RT-LAMP的檢測技術更適用于檢測國內(nèi)流行株IPNV(Jasper),可通過顏色變化(陽性樣本為熒光綠色,陰性樣本為紅棕色)來判定核酸變化的結果。本實驗針對國內(nèi)現(xiàn)行IPNV建立的RT-LAMP方法,具有特異性好、靈敏性強、檢測結果可以通過肉眼觀察直接判斷等特點,且在實際應用中效果準確率高,為我國IPNV基層快速檢測以及大規(guī)模檢測提供支持。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S941.415
【圖文】：

IPNV 在美洲、歐洲、以及亞洲的日本都相IPN 相繼在我國的甘肅[6]、山東[7]、山西[8]等地爆發(fā)。隨出現(xiàn)了 IPN，病毒感染導致流行區(qū)域的虹鱒魚出現(xiàn)大規(guī)模發(fā)地之一[9]。而上世紀的 80 年代到 90 年代，我國分離的R-299[12]。近幾年，我國科學家從四川和云南各分離一株N 的高發(fā)季，一般水溫處于 10~15℃時，發(fā)病率最高，魚方式傳播：一種是水平傳播，這種方式是經(jīng)由漁具、水播病毒；另一種則是垂直傳播，經(jīng)由無癥狀攜帶病毒的魚垂直傳播給后代。IPNV 可導致 14~70 天的幼魚的死亡率帶病毒，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅[15]。觸性和急性傳染病，感染后的鮭鱒魚其特征為肝臟和腎主要病癥表現(xiàn)：游動異常、通體發(fā)黑、眼球突出、肛門壓時可從肛門射出、食欲不振、腹鰭基部出現(xiàn)充血等癥腫大、胰腺出現(xiàn)壞死、腸道有粘液滲出、腹腔有腹水。在有許多出血點，肝臟和胰腺的細胞核固縮，出現(xiàn)空泡，并壞死。

Polymerase），啟動自動循環(huán)鏈置換反應，特異地擴增目的基因；此技術對于靶序列上 6 個各異的特異區(qū)域，設計 4 條特異性引物進行擴增，可在 1 h 內(nèi)擴增出的靶序列拷貝數(shù)約為109~1010倍，具有高時效性[87]。LAMP 技術的擴增模板只能是 DNA，若擴增模板為 RNA 則必須在進行 LAMP 擴增之前利用一定濃度的反轉錄酶將 RNA 逆轉錄成 cDNA，實現(xiàn)對 RN模板的直接擴增，從而形成了 RT-LAMP 技術，這種改進使得 LAMP 技術在檢測試驗中有更多可能性[88]。1.3.2 LAMP 引物設計1.3.2.1 LAMP 引物設計原理引物的特異性是 LAMP 實驗的決定性因素。LAMP 技術擴增基因的關鍵是設計四種特異性引物，并從待擴增的靶序列中選擇六個特定區(qū)域。六個特定區(qū)域是 3’端的 F3c、F2和 F1c 以及 5’端的 B1、B2、B3；3’端的 F3c、F2c 和 F1c 區(qū)和 5’端的 B1、B2 和 B區(qū)；對應互補鏈的區(qū)位為 5’端的 F3、F2 和 F1 區(qū)以及 3’端的 B3c、B2c 和 B1c 區(qū)（圖 2）。Mori Y[89]設計一對環(huán)引物以添加到 LAMP 引物中，添加環(huán)引物使得引物擴增的時效性高，但是在引物設計和篩選中它將變得更嚴格。上游內(nèi)環(huán)引物的 Loop F 設計區(qū)位于 F1c 區(qū)和 F2c 區(qū)間，下游內(nèi)環(huán)引物的 Loop B 設計區(qū)位于 B1c 區(qū)和 B2c 區(qū)之間。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陸冰洋;劉華棟;李婷婷;唐娟;丁樹榮;王彩先;詹麗娥;;傳染性法氏囊病病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2018年15期

2 公政;王瑩;;西瓜花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];貴州農(nóng)業(yè)科學;2016年12期

3 徐穎;徐亞飛;劉永豐;邱志君;鄭煒;;玉米褪綠斑駁病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2017年01期

4 單長林;周圓;李孝軍;楊賽軍;邵煒冬;;RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應用[J];廣東農(nóng)業(yè)科學;2017年07期

5 徐穎;;小麥線條花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立（英文）[J];Agricultural Science & Technology;2014年11期

6 楊卓;于漢勛;李巍;;小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測和鑒別方法的建立[J];中國獸醫(yī)科學;2015年09期

7 張韶華;崔侖標;祁賢;付建光;謝國祥;張洪英;;RT-LAMP法對Ⅱ型諾如病毒的檢測[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2014年15期

8 丁小蘭;趙竹;馬占鴻;張永江;何增磊;李明福;;馬鈴薯帚頂病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J];植物檢疫;2014年05期

9 劉淼;徐黎明;盧彤巖;趙景壯;曹永生;劉紅柏;尹家勝;張金鳳;馮劍;;魚類傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP檢測方法的建立及應用[J];中國水產(chǎn)科學;2014年05期

10 樊粉霞;闞飆;閆梅英;;利用RT-LAMP技術鑒別傷寒沙門菌[J];中國生物化學與分子生物學報;2013年07期

相關會議論文 前10條

1 曾小娜;劉中勇;朱道中;房紅瑩;蔣啟榮;羅滿林;劉鎮(zhèn)明;;豬瘟病毒RT-LAMP實驗診斷初報[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

2 李偉;李剛;范曉娟;張坤;賈風琴;史利軍;Hermann Unger;;小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（下冊）[C];2009年

3 周生;唐夢君;戴亞斌;劉梅;程旭;呂曉娟;;應用逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)檢測傳染性支氣管炎病毒[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

4 董嘉文;孫敏華;尚毅;胡奇林;;禽呼腸孤病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術研討會論文集[C];2010年

5 彭宜;謝芝勛;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;謝麗基;范晴;羅思思;;禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次人獸共患病學術研討會暨第六屆第十四次教學專業(yè)委員會論文集[C];2012年

6 劉中勇;曾小娜;朱道中;房紅瑩;蔣啟榮;吳志強;羅滿林;;豬瘟病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

7 黃元;向華;陳晶;向蓉;張健

本文編號：2741714