【摘要】：鰻弧菌(Vibrio anguillarum),隸屬于弧菌科(Vibrionaceae),是常見的水產動物病原菌,可感染多種海水、淡水或半咸水魚類以及雙殼類和甲殼類動物。鰻弧菌感染宿主引起高致死性的出血性敗血癥,嚴重危害著全球水產養(yǎng)殖業(yè),造成巨大經濟損失。鰻弧菌血清型復雜,目前已知的血清型共23種(O1~O23),其中O1、O2和少部分O3血清型菌株為致病型,其余為環(huán)境株。流行病學調查顯示,O1、O2、O3血清型致病株均流行于我國海水養(yǎng)殖環(huán)境,嚴重危害著我國大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等海水魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。隨著魚類免疫學研究的不斷深入與疫苗免疫技術的不斷發(fā)展,魚用疫苗正逐漸取代抗生素成為水產動物疫病防治的主流手段。1.本實驗在實驗室搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下對鰻弧菌VAM003株生長條件進行了初步優(yōu)化,采用單因素實驗法對氯化鈉濃度、氮源種類及氮源添加量、碳源種類及碳源添加量進行篩選。實驗結果顯示,培養(yǎng)基中氯化鈉濃度應不低于1%;氮源中胰蛋白胨促生長作用最佳,當添加量為2%時菌產量達峰值;碳源中蔗糖促生長作用最佳,添加量為1.5%時菌產量達到峰值。2.本次實驗在5 L發(fā)酵罐基礎上,以含2.5%氯化鈉的TSB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,以鰻弧菌VAM003株為對象,研究了二級種子液培養(yǎng)時間、發(fā)酵培養(yǎng)基氯化鈉濃度、二級種子液接種量、補料發(fā)酵,初步建立了發(fā)酵工藝:種子液按10%接種量接種到300 mL氯化鈉濃度為2.5%的TSB培養(yǎng)基,28℃,180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12~14h得二級種子液;按10%接種量將二級種子液接種到發(fā)酵罐,28℃,通氣攪拌培養(yǎng),發(fā)酵4 h后開始勻速添加補料葡萄糖,6 h后開始勻速添加補料10倍濃縮的TSB,發(fā)酵培養(yǎng)10~12 h后收獲菌液。隨后在500 L發(fā)酵罐進行了放大培養(yǎng),培養(yǎng)10 h后菌液OD600值達最大值,此時菌液活菌數為12.0×10~9 CFU/mL。3.本實驗對大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗(VAM003株)中試產品進行了免疫效力評價,檢測了疫苗穩(wěn)定性、保存期、安全性、最小免疫劑量、對不同規(guī)格大菱鲆免疫保護效果、對同O1血清型其他菌株及O2、O3血清型菌株的交叉保護作用。實驗結果表明疫苗穩(wěn)定性良好,不同生產批次疫苗免疫后28天RPS均達到100%,單劑量重復注射后也未有不良反應產生,最小免疫劑量為0.025 mL/ind,對體重50 g以上的大菱鲆均有免疫保護作用,疫苗在4℃條件下至少可貯存18個月。4.本課題在鰻弧菌二價(O1/O2)滅活疫苗的基礎上以鰻弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)為抗原制備了抗原濃度為10~8 cells/mL及10~9 cells/mL的鰻弧菌三價疫苗,將大菱鲆隨機分為2免疫組和1空白對照組,2免疫組以0.1mL/ind腹腔注射免疫大菱鲆即10~7 cells/ind組、10~8 cells/ind組,對照組注射相同劑量滅菌PBS。一次免疫60天后同法對10~8 cells/ind組進行了一次加強免疫,并檢測了一次免疫后150天內及同時期二次免疫大菱鲆對三種抗原的血清凝集效價和RPS。實驗結果顯示,一次免疫3天后可檢測到10~7 cells/ind組和10~8 cells/ind組大菱鲆抗鰻弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)抗體,14天后兩免疫組(10~7 cells/ind、10~8 cells/ind組)VAM003、VAM007、M2016261抗體效價快速升高,28天后抗體效價均達到峰值1:248.89~1:320,顯著高于空白組(P0.05)。28~60天10~7 cells/ind組VAM003、VAM007、M2016261抗體效價保持在1:151.11~1:320,28~150天10~8 cells/ind組VAM003、VAM007、M2016261抗體效價保持在1:106.67~1:320。二次免疫3天后可檢測到二免組VAM003、VAM007、M2016261血清抗體效價均高于同期一免組,14天后顯著高于同期一免組(P0.05),隨后抗體效價均開始下降,60~90天血清效價與同期一免組無顯著差異(P0.05)。攻毒實驗結果顯示,免疫7天后,10~7 cells/ind組和10~8 cells/ind組三種抗原的RPS在5.56~43.75%,14天后10~7 cells/ind組和10~8cells/ind組三種抗原的RPS均快速升高,28天后均達到最大值100%,60天后10~7cells/ind組VAM003下降至71.43%,其余均保持在70%及以上,10~8 cells/ind組RPS均保持在90%以上。120天后10~8 cells/ind組VAM003 RPS開始下降,150天后VAM003RPS下降到35%,VAM003下降到65%,而M2016261還保持在較高水平100%。二次免疫30~60天三種抗原RPS保持在80%以上,均不低于同時期一次免疫組,90天后VAM003 RPS下降到75%,VAM007、M2016261仍保持在80%以上。綜上所述,高劑量三價疫苗(10~9 cells/mL)抗體持續(xù)期為免疫后28~150天,若取RPS70%為有效免疫保護率,一次免疫后能為大菱鲆提供至少120天的免疫保護期,二次免疫后免疫保護期延長至150天。低劑量疫苗(10~8 cells/mL),抗體持續(xù)期及免疫保護期至少為60天。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S948
【圖文】：

MN MHK6 LSV7 SMW7 SMW5 SMW1 SMQ29 SMQ23（a）M5 VAM003 M1 LSV1 L70 2301 1703 0401

圖 4-2 鰻弧菌 O2、O3 血清型臨床株全菌抗原蛋白檢測Fig.4-2 The detection of total bacterial antigen protein in vibrio O2 & O3 serotype.4.3. 小結與討論魚用疫苗的研究始于上世紀 40 年代，70 年代首例商品化疫苗誕生。迄今為止，全球已有 140 余種疫苗獲得生產許可，美洲、歐洲、東亞等地區(qū)已建立工業(yè)化疫苗生產基地，在 Alpharma、Aqua Health、Intervet 和 Bayotek 等魚用疫苗領頭企業(yè)的帶動下，不少國際制藥企業(yè)紛紛涉足魚用疫苗領域[2]。我國魚用疫苗的究起步雖晚，但發(fā)展速度較快，近 10 年魚用疫苗取得了不少研究進展，但很少有疫苗制品進入中試階段。本次實驗參考獸用疫苗臨床試驗申請要求，對大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗（VAM003株）中試產品進行了免疫保護效力評價，從疫苗生產工藝即不同批次疫苗穩(wěn)定性、疫苗安全性、適宜免疫規(guī)格、最小免疫劑量、疫苗保存期及疫苗交叉保護作用對疫苗制品進行了評估。檢驗結果顯示，3 批大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗（VAM003 株）中試產品免疫后 28 天 RPS 均達到 100%，表明疫苗生產工藝合理，產品質量穩(wěn)定，符合批量

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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本文編號：2739595