【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)作為中國(guó)重要淡水養(yǎng)殖珍珠的育珠貝,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其所產(chǎn)珍珠顏色艷麗多彩,而珍珠顏色直接影響其價(jià)值。已有的研究表明,三角帆蚌珍珠顏色與黑色素生成有關(guān),同時(shí)也有研究在不同顏色珍珠中都發(fā)現(xiàn)了卟啉的存在,是影響珍珠致色的重要物質(zhì)之一。本研究是基于實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的紫色、白色三角帆蚌家系為研究對(duì)象,篩選與珍珠層顏色相關(guān)的小眼畸形先關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因和尿卟啉原Ⅲ合成酶基因,研究其與三角帆蚌貝殼珍珠層呈色中的作用與影響。主要研究結(jié)果如下:1.三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因的克隆及其表達(dá)分析克隆得到三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因(GenBank:MH349354)cDNA全長(zhǎng)2664bp,包含1332bp的ORF,編碼了443個(gè)氨基酸。HcMitf基因氨基酸序列包含一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(bHLH),沒(méi)有信號(hào)肽。組織定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HcMitf基因在各個(gè)組織中廣泛表達(dá),并且除了腸和閉殼肌外,與白色蚌相比,該基因在紫色蚌中的血液、外套膜、腎臟、鰓以及斧足中的表達(dá)極顯著(P0.01)。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明,HcMitf位于外套膜的背膜上皮細(xì)胞,并顯示出了陽(yáng)性雜交信號(hào)。2.三角帆蚌小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcMitf基因的功能探究首先,利用RNAi技術(shù)探究HcMitf基因與下游HcTyr基因在黑色素合成過(guò)程中的作用。通過(guò)注射HcMitf的dsRNA干擾鏈,結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相較而言,陰性對(duì)照組的這兩個(gè)基因表達(dá)量均未有顯著變化,而實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量降低了78%(p0.01),表明該干擾鏈成功抑制了HcMitf基因的表達(dá),干擾效果較好,同時(shí)下游基因HcTyr表達(dá)也極顯著降低。與此同時(shí),總黑色素含量測(cè)試表明,實(shí)驗(yàn)組的外套膜總黑色素含量顯著低于空白對(duì)照組。其次通過(guò)插片手術(shù),探究了HcMitf和HcTyr在三角帆蚌珍珠早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化及其相關(guān)性。在插片手術(shù)后,HcMitf和HcTyr的表達(dá)均在6h達(dá)到了頂峰,并且在96h回到正常值。隨后HcMitf在14d表達(dá)量相較于正常值又有顯著提高,而HcTyr表達(dá)量則在35d有了顯著差異。同時(shí)通過(guò)correl函數(shù)將這兩個(gè)上下游基因的表達(dá)量進(jìn)行線性相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性(R=0.919)。3.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros基因的克隆及其表達(dá)分析通過(guò)分子克隆技術(shù)得到HcUros基因(GenBank:MK599473)cDNA全長(zhǎng)1448bp,包含858bp的ORF,一共編碼了285個(gè)氨基酸,沒(méi)有信號(hào)肽。經(jīng)熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HcUros基因在紫白色蚌各個(gè)組織中表達(dá)較為廣泛,并且該基因在紫色蚌中的表達(dá)量都高于白色蚌中的表達(dá)量,并且與白色蚌相比,在紫色蚌的外套膜和血液中的表達(dá)量顯著(P0.01)。原位雜交定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HcUros位于外套膜的背膜上皮細(xì)胞,出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)。4.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros的功能探究首先通過(guò)RNAi技術(shù)探究HcUros基因與下游HcPpo基因在卟啉合成途徑中的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)注射HcUros的dsRNA干擾鏈,結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組中HcUros的表達(dá)量未有明顯的變化,而實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量降低了62.5%(p0.01),表明該干擾鏈成功抑制了HcUros基因的表達(dá),干擾效果較好,同時(shí)下游基因HcPpo表達(dá)也顯著降低。其次通過(guò)插片手術(shù)來(lái)研究HcUros在三角帆蚌珍珠早期發(fā)育時(shí)期中的參與調(diào)控。在插片實(shí)驗(yàn)后,HcUros的表達(dá)量在3h顯著降低后一直到48h和96h又顯著升高,7d又回到正常值,最后在28d表達(dá)量達(dá)到峰值。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 2-1：左圖為紫色三角帆蚌的內(nèi)殼色，右圖為白色。Fig2-1;Inner shell color of H. cumingii. Left:The purple (P-) mussel line; Right: white (W-).2.1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備儀器名稱 儀器來(lái)源微量移液器 德國(guó) Eppendorf 公司高速冷凍離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf 公司連接儀 德國(guó) Eppendorf 公司HVE-50 型高壓滅菌鍋 日本 Hirayama 公司液氮 成都金鳳液氮容器有限公司NanoDrop 2000C 型 OD 儀 美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司BS124S 型多功能精密電子天平 德國(guó) Sartorius 公司超純水儀 Millipore 公司電泳槽 北京六一儀器廠

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文Fig.2-2：Full-length nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the HcMitf (Geneaccession is MH349354). The gray box indicates the predicted basic helix-loop-helix (bHLH)domain and the predicted polyadenylation signal AATAAA is underlined.2.2.2 多重比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析使用 ClustalW 軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析（圖 2-3A），選取不同物種中的MITF 與獲得的 HcMitf 進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們之間有著較高的相似度。用 MEGA5.2將不同物種的 MITF 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖 2-3B），根據(jù)結(jié)果顯示，HcMitf與中華文蛤（Meretrix petechialis）親緣關(guān)系最近。

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本文編號(hào)：2734923