【摘要】：在水生生態(tài)系統(tǒng)中,由于季節(jié)變化、光合作用、風(fēng)、鹽度、溫度、晝夜變化等自然因素以及環(huán)境污染、水體富營養(yǎng)化和全球變暖問題等人為因素的存在,氧氣含量可在時間和空間上發(fā)生劇烈變化。此外,在常見的高密度、淺池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,高養(yǎng)殖密度以及高營養(yǎng)輸入導(dǎo)致增殖的浮游動植物引發(fā)水華,使得水體溶解氧含量低且不穩(wěn)定,成為魚類養(yǎng)殖的一個巨大威脅。雖然魚類已經(jīng)具備了在低氧水域環(huán)境下存活的能力,但是這種生存能力是依賴于一套完整的氧氣感受、基因-蛋白互作調(diào)控等應(yīng)對機制。目前低氧脅迫研究已經(jīng)成為魚類生理學(xué)的熱點之一,然而關(guān)于瓦氏黃顙魚應(yīng)對低氧脅迫的分子調(diào)控機制的研究未見報道。瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)是黃顙魚屬魚類中個體最大的一種,最大個體體質(zhì)量達1850g,但是該魚耐低氧能力較黃顙魚差,連續(xù)陰雨天氣、密度過高等導(dǎo)致的低氧會致使其死亡,該魚在我國高密度池塘養(yǎng)殖較少,但其具有生長速度快、食性雜、容易馴養(yǎng)、肉味鮮美等優(yōu)點,同樣也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個很有養(yǎng)殖前景的品種,而且在日本、韓國、東南亞等國家也有巨大的市場潛力,是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種。目前,瓦氏黃顙魚產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模,迫切需要培育耐低氧新品種,這也是瓦氏黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要條件。然而至今為止,該物種只有少數(shù)EST和蛋白質(zhì)序列可用,遺傳資源的缺乏嚴(yán)重阻礙了其在分子育種以及特定生物學(xué)過程中的深入研究�？梢�,瓦氏黃顙魚的這些特征表現(xiàn)出它不僅僅是一個具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,而且是一個潛在的可以用來研究低氧和再氧化分子調(diào)節(jié)機制的模型物種。本論文以瓦氏黃顙魚為實驗對象,一方面,運用第二代測序技術(shù)對低氧脅迫前后(溶氧量0.7 mg/L; 4h)瓦氏黃顙魚肝臟的轉(zhuǎn)錄組、miRNA組、蛋白質(zhì)組進行聯(lián)合和對比研究;另一方面,研究了低氧脅迫(溶氧量0.7mg/L; 1.5h, 4h, 6.5h)和恢復(fù)下(溶氧量6.8mg/L; 1.5h, 4h, 6.5h)對瓦氏黃顙魚氧傳感蛋白、呼吸代謝及血液指標(biāo)的影響,同時在低氧脅迫和恢復(fù)下對瓦氏黃顙魚氧化應(yīng)激參數(shù)進行分析,期望在分子水平上系統(tǒng)地闡明魚類應(yīng)對低氧脅迫的分子調(diào)控機制,也為今后開展魚類耐低氧新品種選育提供一定的理論依據(jù)。本論文研究結(jié)果主要包括以下4個部分:1.低氧脅迫下瓦氏黃顙魚肝臟mRNA-seq和miRNA-seq聯(lián)合分析(轉(zhuǎn)錄水平)通過miRNA組和轉(zhuǎn)錄組測序分析低氧脅迫前后瓦氏黃顙魚肝臟共獲得18個差異miRNA和961個差異mRNA,結(jié)合miRNA預(yù)測的靶基因進行聯(lián)合分析后共獲得162個 negative miRNA-mRNApairs,包括 18 個差異 miRNA 和 107 個 mRNA。對所涉及到的轉(zhuǎn)錄組和聯(lián)合分析的差異基因進行KEGG pathway富集性分析,根據(jù)數(shù)據(jù)的綜合分析以及對 21 個差異基因(PFKL、HK、LDH、PGAM、LPL、BCL2、Vhl、TFRC、SLC2A1、VEGF、EPO、DAPK、JUN、ANGPTL4、CA、PRKAG2、ATF2、CREM、IRS、Akt 和 DUSP8)和 13 個差異 miRNA (miR-143、miR-17、miR-27b、miR-301c、miR-338、miR-3618、miR-210、PC-3p-36625_60、PC-5p-83983_9、miR-338、miR-16a、miR-20a和miR-301a)進行qRT-PCR驗證,結(jié)果顯示瓦氏黃顙魚為了在急性低氧條件下維持正常的生理活動,在轉(zhuǎn)錄水平上通過miRNA-mRNApairs調(diào)控一些重要的信號通路(如 HIF-1 signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis、AMPK signaling pathway等)并導(dǎo)致一系列生物學(xué)過程,包括促進血紅細(xì)胞增殖,促進血管生成,抑制細(xì)胞凋亡;有氧代謝和無氧代謝的轉(zhuǎn)換;減少能量消耗和生物合成。2.低氧脅迫和恢復(fù)對瓦氏黃顙魚氧傳感蛋白、呼吸代謝及血液指標(biāo)的影響以HIF-1 signaling pathway為主線,系統(tǒng)地開展瓦氏黃顙魚低氧脅迫下大腦和肝臟組織相關(guān)基因、蛋白、酶活性的時序表達研究,通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)氧傳感蛋白(HIFs、PHDs、FIH和Vhl)在肝臟或大腦中表達較高。在低氧脅迫和恢復(fù)條件下,氧傳感蛋白mRNA表達量和HIF-1α蛋白表達量都顯著上調(diào),這些氧傳感蛋白(尤其是HIF-1α)可以作為環(huán)境低氧的分子指標(biāo);同時,在低氧下上調(diào)的PHDs可能在恢復(fù)下反饋調(diào)節(jié)HIFs以終止低氧反應(yīng);瓦氏黃顙魚在低氧和恢復(fù)下:通過提高RBC、HB和SI來增加血液攜帶氧氣的能力,通過提高糖酵解相關(guān)酶活性(PFK、HK和PK)和無氧呼吸關(guān)鍵酶(LDH)來增加無氧呼吸能力,同時低氧下在肝臟組織中降低了有氧呼吸酶活性(CS)來抑制有氧呼吸。以上生物學(xué)過程是瓦氏黃顙魚為了應(yīng)對低氧和恢復(fù)下能夠進行正常生命活動獲取能量所作出的代謝改變,代謝模式為有氧呼吸至無氧呼吸的轉(zhuǎn)變。3.低氧脅迫下瓦氏黃顙魚肝臟差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析(翻譯水平)通過基于iTRAQ的蛋白質(zhì)測序分析低氧脅迫前后瓦氏黃顙魚肝臟共獲得511個差異蛋白,在對511差異表達蛋白的KEGG pathway富集性分析中,“Metabolism”是被富集到最多的生物學(xué)過程大類別,包括幾個重要的生物學(xué)過程小類別“Xenobiotics biodegradation and metabolism”、“Lipid metabolism”、“Carbohydrate metabolism”和“Amino acid metabolism”幾個子類。值得注意的是一些重要的pathway同樣被富集到,如 Peroxisome (屬于“Transport and catabolism” pathway 小類別)和 PPAR signaling pathway (屬于“Endocrine system” pathway小類別)。根據(jù)在翻譯水平上數(shù)據(jù)的綜合分析以及對 6 個差異基因(PCK1、TGL2、MGEA5、PGAM1、UGT2A2、HYI)和 6個差異蛋白(PCK1、PGAM1、TGL2、TAT、PGK1、MDH1)的驗證,結(jié)果表明瓦氏黃顙魚肝臟低氧適應(yīng)生物學(xué)過程是Peroxisome和PPAR signaling pathway主導(dǎo)過氧化物的降解和代謝以及脂質(zhì)代謝,另外代謝模式為有氧代謝至無氧代謝的轉(zhuǎn)換以及減少能量消耗和生物合成。4.低氧脅迫和恢復(fù)對瓦氏黃顙魚氧化應(yīng)激損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響為了探究低氧脅迫和恢復(fù)對瓦氏黃顙魚氧化應(yīng)激損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響,首先對瓦氏黃顙魚SOD1和SOD2基因的cDNA全長進行序列分析以及組織表達進行分析,結(jié)果表明SOD1在肝臟中表達最高,而SOD2在心臟和大腦中表達較高。然后對瓦氏黃顙魚在低氧脅迫和恢復(fù)中SODs基因和蛋白的表達水平進行系統(tǒng)研究,同時對氧化應(yīng)激參數(shù)(MDA、CP和LPO)及抗氧化酶(GR、CAT、GST、GPx和SOD)進行檢測,結(jié)果表明在瓦氏黃顙魚肝臟中抗氧化酶(CAT、GST、GPx和SOD)在機體面臨氧化應(yīng)激之前逐漸升高,與M. Hermes-Lima提出的猜想“氧化應(yīng)激準(zhǔn)備”相一致。在瓦氏黃顙魚大腦中,氧化應(yīng)激參數(shù)(CP和LPO)在低氧脅迫下降低,而且抗氧化酶(SOD、GPx、GST、GR)也顯著降低,表明了環(huán)境低氧導(dǎo)致瓦氏黃顙魚大腦組織中新陳代謝減痕以減少ATP的利用,從而減少線粒體呼吸鏈上電子的攜帶和殘留氧氣分子的電子傳遞以減少ROS的水平,減少氧化應(yīng)激對大腦的負(fù)面影響,這也驗證了魚類在低氧下,為保護心臟或大腦這類對生存起重要作用的組織,血液會重新分配以保證這些組織在低氧狀態(tài)下能夠維持基本生存。在恢復(fù)條件下,瓦氏黃顙魚肝臟和大腦中氧化應(yīng)激參數(shù)及抗氧化酶都顯著升高,這表明了伴隨著大量氧氣的輸入導(dǎo)致代謝補償,ROS的濃度迅速上升,因而出現(xiàn)了恢復(fù)過程中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

ＤＮＡ在ＲＮＡ聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成前提ｍＲＮＡ邋（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ），之后ｐｒｅ－ｍＲＮＡ要逡逑經(jīng)過５’端加帽子以及３’端加尾，ｍＲＮＡ剪接（ｍＲＮＡ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ），即ｍＲＮＡ前體去除逡逑掉內(nèi)含子而保留外顯子的修飾過程（中心法則見圖１．２）。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)逡逑構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，了解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細(xì)胞及組織中分子逡逑組成所必須的，并也對理解機體發(fā)育和疾病具有重要作用。逡逑Ｃｅｎｔｒａｌ邋ｄｏｇｍａ邋ｏｆ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｂｉｏｌｏｇｙ邋￣娜。哪邋ＢａｓｅＰａｉｒ逡逑＼邋：－／逡逑Ｇｅｎｏｍｅ邐ｉｊ逡逑．．？？＊＂＊邋ｃ邋＼邋Ｕ逡逑Ｚ邐＿邋Ｅｘｏｎ逡逑Ｇｅｎｅ邋邐（邋＂邋１邋１邐邋１．１邐ｈ：七邋ｌ｜ｌ；ｉ邐ａ邐炫找Ｕｉ邋逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋｜｜邐、、ｉｍｒｏｎ邋Ｚ逡逑§邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡ邋ｉ邐Ｉ￣——邐Ｉ邋ｆｍ邋微逡逑￡邐Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋ｊｊ邐Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋｜Ｊ逡逑ｃｄ邋ｍＲＮＡ邐ｌ邐（邐，ｉ，，：，：，邋：］ｉｗ：：｜逡逑Ｑ＞逡逑Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ邋ｊｊ邐Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ邋｜｜逡逑ｐｒ0，ｅｉｎ逡逑圖１．２分子生物學(xué)的中心法則逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｃｅｎｔｒａｌ邋ｄｏｇｍａ邋ｏｆ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｂｉｏｌｏｇｙ逡逑根據(jù)所研宄物種是否有參考基因組以及注釋信息，轉(zhuǎn)錄組測序可分為有參轉(zhuǎn)錄組逡逑和無參轉(zhuǎn)錄組測序兩種類型。對于有參轉(zhuǎn)錄組測序，通過將測序ｒｅａｄｓ映射到參考基逡逑因組上

Ｆｉｇ．邋２．２邋Ａ邋ｆｌｏｗ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ邋ｌｉｂｒａｒｙ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑ逡逑２．２．３轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理和Ｔｒｉｎｉｔｙ拼接逡逑１．?dāng)?shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理逡逑通過高通量測序儀獲得的ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ原始數(shù)據(jù)（２＞＜１２５ｂｐ），其中可能含有帶接頭逡逑的（建庫過程引入）和低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)（由測序儀器本身產(chǎn)生）。為了確保準(zhǔn)確、逡逑可信的分析結(jié)果，需要對于原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，得到有效數(shù)據(jù)（Ｖａｌｉｄ邋ｄａｔａ），以用逡逑于后續(xù)的信息分析。測序數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟如下：逡逑（１邐）去除帶接頭（Ａｄａｐｔｏｒ邋）的邋ｒｅａｄｓ邋：邐ＲＡ５逡逑５，ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ逡逑ＧＡＴＣＴ－３，和邋ＲＡ５邋５，ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ邋（ｉｎｄｅｘ）逡逑ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’。逡逑（２）去除含有Ｎ邋（Ｎ表示無法確定堿基信息）的比例大于５％的ｒｅａｄｓ。逡逑（３）去除低質(zhì)量的Ｒｅａｄｓ邋（質(zhì)量值＜＝１０的堿基數(shù)占整個ｒｅａｄｓ的２０％以上。逡逑（４）統(tǒng)計原始測序量，有效測序量，Ｑ２０，Ｑ３０，邋ＧＣ含量。逡逑．

本文編號：2732864