【摘要】：牙鲆Paralichthys olivaceus)是我國(guó)的重要海水養(yǎng)殖魚類,病害頻繁發(fā)生影響該養(yǎng)殖品種的可持續(xù)發(fā)展。熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的伴侶蛋白,在環(huán)境脅迫和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,了解牙鲆熱激蛋白的作用機(jī)制對(duì)疾病防治有重要的意義。本研究開(kāi)展了牙鲆Hsp90α和Hsp90β基因在溫度刺激和病原菌感染下表達(dá)變化,旨在為牙鲆疾病控制提供理論指導(dǎo)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1. Hsp90基因在不同發(fā)育期牙鲆的表達(dá)分布：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)Hsp90α和Hsp90β基因mRNA在不同發(fā)育期牙鲆(20g-lKg)的表達(dá)分布,結(jié)果顯示,Hsp90α和Hsp90β在檢測(cè)的不同發(fā)育期牙鲆的13種組織(肝臟、脾臟、頭腎、后腎、心、肌肉、皮膚、胃、腸、鰓、腹鰭、腦和血液)中均有表達(dá)。在檢測(cè)的不同發(fā)育期牙鲆中Hsp90β的表達(dá)水平整體高于Hsp90α;檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)在8月齡(200g±50g)牙鲆在肝、鰓、背皮、背肌、腹鰭的Hsp90α表達(dá)量要顯著高于其他發(fā)育期同組織的表達(dá)量(P0.05),而Hsp90β在各不同大小牙鲆的表達(dá)量也具有明顯的差異。2.溫度和鰻弧菌感染對(duì)牙鲆Hsp90基因表達(dá)的影響：選取8月齡牙鲆在5-32℃C刺激1h后,牙鲆肝臟、脾臟Hsp90α在高溫(22-32℃)的表達(dá)量急驟升高,而Hsp90β在不同溫度刺激期間表達(dá)量變化較��；在10℃、28℃連續(xù)刺激8h,Hsp90α和Hsp90β的mRNA的表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì),Hsp90α在高溫時(shí)的表達(dá)量變化幅度明顯高于Hsp90β。用鰻弧菌感染8月齡牙鲆,在感染72h內(nèi),牙鲆脾臟Hsp90α和Hsp90β的表達(dá)量先降后升,Hsp90β上升的幅度明顯(P0.05)。結(jié)果表明,Hsp90α對(duì)高溫?zé)釕?yīng)激的反應(yīng)明顯,Hsp90β在對(duì)病原菌感染的反應(yīng)明顯。3.牙鲆Hsp90α的原核表達(dá)：將Hsp90α基因克隆到pBAD/gⅢA質(zhì)粒中,構(gòu)建重組載體pBAD/gⅢA-Hsp90,并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)以及做質(zhì)譜表達(dá)分析驗(yàn)證,結(jié)果表明重組蛋白得到正確表達(dá),為后續(xù)對(duì)Hsp90α蛋白的研究提供基礎(chǔ)條件。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

第一個(gè)中間狀態(tài)［１３］（圖化）。伴隨結(jié)構(gòu)的變化引起相應(yīng)的閉合狀態(tài)，結(jié)構(gòu)壓縮形成第二個(gè)逡逑中間狀態(tài)Ｍ，其中ＮＴＤ結(jié)構(gòu)域的二聚化與ＭＤ域有關(guān)。其中的ＡＴＰ被水解，ＡＴＰ水解后，逡逑將Ｎ－結(jié)構(gòu)域解離，釋放ＡＤＰ，Ｐｉ和Ｈｓｐ９０的返回到其原始構(gòu)型［ｉｓ］（圖２ｃ）。逡逑３邐（邋ＮＴＤ逡逑％廬寒ｓ逡逑ｍ邐ｗｗ逡逑Ｅ．邋ｃｏｌｉ邐Ｓ．邋ｃｅｒｅｖｉｓｉｏｅ邐Ｃ邋ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ逡逑（ＰＤＢｃｏｄｅ２１０Ｑ）邐｛ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋２ＣＧ９）邋（ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋２０１Ｕ）逡逑圖ｌｈｓｐ９０結(jié)構(gòu)規(guī)ａ，邋ｈｓｐ９０結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，ｂ，Ｎ－結(jié)構(gòu)域Ｗ黃色示出，Ｍ－域在綠色和Ｃ－結(jié)構(gòu)域?yàn)閰湾义仙ㄒ裕校模碌鞍讛?shù)據(jù)庫(kù)）逡逑Ｆｉｇ邋１邋ｈｓｐ９０邋ｄｏｍａｉｎ，ａ，邋ｈｓｐ９０邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，邋ｂ，Ｎ－邋ｄｏｍａｉｎ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗ打邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ，Ｍ－邋ｄｏｍａｉ打邋ｉｎ邋ｇｒｅｅｎ逡逑ａｎｄ邋ｂｌｕｅ邋Ｃ－邋ｄｏｍａｉｎｓ邋（ｑｕｏｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＰＤＢ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄａｌ；ａ邋ｂａｎｋ）逡逑

圖４邋２８’Ｃ處理化后牙卿肝臟和脾臟Ｈｓｐ９０邋ｎｉＲＮＡ的表達(dá)逡逑巧臟Ｈｓｐ９０ａｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)量；Ｂ；巧臟Ｈｓｐ９０ｐｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)量；Ｃ：牙輯脾臟Ｈｓｐ９０ａ逡逑的相對(duì)表達(dá)量；Ｄ：脾臟Ｈｓｐ９０ｐｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)量；ａ，邋ｂ，Ｃ，ｄ代表各組之間的差異性，相逡逑為差異不顯著（尸＞０．０５），不同字母表示差異顯著（戶＜０．０５）。逡逑ｅｌａｔｉｖｅ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋Ｈｓｐ９０邋ｇｅｎｅ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｓｐｌｅｅｎ邋ｏｆ邋＇Ｐ．邋ｏｌｉｖａｃｅｕｓ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ａｔ邋２８邋°Ｃ邋ｆｏｒ逡逑８ｈ逡逑鮮感染橩弧菌后Ｈｓｐ９０基因的表達(dá)逡逑

本文編號(hào)：2730580