【摘要】：傳染性造血器官壞死病(Infectious Hematopoietic Necrosis,IHN)是經(jīng)常出現(xiàn)在鮭鱒魚科中,極其容易造成一些鮭鱒魚發(fā)生急性病毒性死亡的嚴(yán)重的魚類傳染病。該類傳染病死亡率極高,尤其在魚苗中危害極廣。已有研究表明,傳染性造血組織壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)呈子彈狀,被分類為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、諾拉彈狀病毒屬(Novirhabdovirus),基因組為單股負(fù)鏈RNA。IHNV-G蛋白被證實表面有囊膜結(jié)構(gòu)。IHNV-G蛋白作為一種免疫原,進入機體后,可引發(fā)機體的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致特異性抗體的產(chǎn)生及釋放,抗體可以與IHNV-G蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。本實驗從GeneBank上檢索到59個IHNV的G蛋白基因,經(jīng)過比對,我們在保持氨基酸序列不變、讀碼框整體正確的條件下,人為進行調(diào)整。最后我們選擇保守密碼子進行整體優(yōu)化,Kpn I和Sal I酶切位點分別添加在序列兩端,His標(biāo)簽添加于N端,最終確定一條總長1545bp IHNV-G蛋白的序列。合成得該序列,再將原核表達(dá)載體pET-30a與這個基因序列連接,pET-30a-IHNV-G是合成的重組表達(dá)質(zhì)粒。對pET-30a-IHNV-G進行PCR、雙酶切和測序等驗證,經(jīng)過確定后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plySs中,再通過誘導(dǎo)使重組菌表達(dá),IHNV-G蛋白表達(dá)情況通過蛋白免疫印記實驗進行驗證。保證其他條件不變,分別在誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度等方面來優(yōu)化表達(dá)條件,借此來獲得該蛋白發(fā)酵的最佳工藝。利用超聲破碎將菌體裂解離心后,將上清液和沉淀物分別收集,進行SDS-PAGE分析,最終得以確認(rèn)IHNV-G蛋白的是以包涵體的形式表達(dá)。包涵體收集之后,首先洗滌,再變性和復(fù)性之后,分離純化目的蛋白,除鹽凍干后,獲得IHNV-G蛋白。利用該蛋白切膠回收對白兔進行免疫,獲得抗體,進而建立間接酶聯(lián)免疫方法檢測傳染性造血器官壞死病毒。研究結(jié)果:實驗順利的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-IHNV-G。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后,陽性重組菌株表達(dá)出IHNV-G蛋白。保證其他條件不變,在1 mmol/L誘導(dǎo)物、37℃條件下發(fā)酵4 h達(dá)到最佳效果,IHNV-G蛋白以包涵體形式表達(dá),平均1 L發(fā)酵液純化后得到7 g菌體及0.2~0.3 g蛋白干粉。純化蛋白復(fù)性后進行動物免疫獲得的抗體,應(yīng)用間接ELISA技術(shù),檢測到抗血清對IHNV-G和IHNV的效價分別達(dá)到1:32000和1:16000,與其它對照病毒無交叉反應(yīng)。與PCR檢測結(jié)果符合率達(dá)到98%。結(jié)論本文建立的間接酶聯(lián)免疫法方法具有良好的靈敏性和特異性,為IHNV的檢測提供了快捷、高效的技術(shù)手段。為進一步建立傳染性造血器官壞死病毒感染的膠體金免疫試紙條快速檢測方法奠定了理論和實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S941.414
【圖文】：

pMD-18重組質(zhì)粒

pET30a質(zhì)粒

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2730089