【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作為我國重要的淡水珍珠貝,具有非常高的經(jīng)濟價值。在珍珠養(yǎng)殖過程中,插片移植是人工培育珍珠過程中的核心環(huán)節(jié)。供體貝的外套膜細胞小片插入受體貝中,刺激外套膜分泌珍珠質,一層薄薄的上皮細胞逐漸生成并包裹著小片形成珍珠囊,然而育珠貝在移植后一般會對外源的外套膜細胞小片產(chǎn)生免疫排斥,同時機體還受到外部環(huán)境中的病原細菌的危害,插片移植后的受體貝很有可能產(chǎn)生脫片,感染病菌發(fā)生炎癥反應甚至導致死亡。因此,為了獲得高產(chǎn)量和高質量的珍珠,我們需要準確掌握插片手術后育珠貝和外套膜細胞小片的生理免疫狀態(tài)的變化,全面了解珍珠囊發(fā)育時期的免疫因子調節(jié)機制,在珍珠囊形成的關鍵時期采取有效的護理措施,為推動珍珠行業(yè)的高效可持續(xù)發(fā)展提供科學理論依據(jù)。本文利用二代測序技術,對三角帆蚌進行插片手術后,收集了0h,2h,6h,12h,24h,48h,96h,7d,14d和30d十個時期的珍珠囊樣品,構建了三角帆蚌珍珠囊發(fā)育轉錄組文庫。組裝軟件拼接后,獲得了293863條平均長度為588bp unigenes,最長的為27255bp,N50讀長為840bp,其中27176條unigenes在數(shù)據(jù)庫中得到了注釋。將unigenes映射到KEGG代謝途徑后,我們發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號通路、補體與凝血級聯(lián)反應、NOD受體信號通路、B細胞受體信號通路、趨化因子信號通路等15條涉及免疫功能的代謝通路在KEGG子類別中也被鑒定出來。緊接著,將珍珠囊10個時期的轉錄組文本集兩兩對比,篩選鑒定得到4878條差異基因(DEGs)。依據(jù)DEGs的珍珠囊發(fā)育時空表達譜,構建二維主元分析圖和聚類分析熱圖,分析后推測插片移植后細胞小片和育珠貝的生理狀態(tài)恢復正常需要一個月。同時,我們將移植手術后育珠貝的生理狀態(tài)分為6個階段:0h,2h-6h,12h-24h,48h-7d,14d,30d,并重點研究0/2h,6 h/12 h,24 h/48 h,7 d/14 d和14 d/30d這五組差異基因表達和調控機制。通過對關鍵時間點差異基因的Gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,發(fā)現(xiàn)各對比組的差異基因顯著富集在補體與凝血級聯(lián)反應、MAPK信號通路、TLR信號通路和幾丁質代謝通路中,對此展開具體討論。此外,本文選取了8條免疫差異基因進行實時熒光定量驗證,線性相關系數(shù)r值分布在0.86到0.97之間,表明熒光定量驗證結果和測序結果具有高度一致性,進而證明了轉錄組測序結果的準確性�；谝陨戏治鼋Y果,本文利用分子生物學、細胞生物學等手段,重點研究了Toll樣信號通路中的免疫差異基因Interleukin-1 receptor-associated kinase 4(IRAK4)和Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)。首先克隆了三角帆蚌IRAK4基因,該基因的cDNA全長2595bp,開放閱讀框1674bp,編碼了557個氨基酸蛋白序列,預測的蛋白分子量為62.3 kDa,理論等電點為5.34。HcIRAK4蛋白高度保守,含有一個N端死亡結構域(DD,5 115aa)、以及絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶結構域(STYKc,270 553aa)。熒光定量PCR顯示HcIRAK4的mRNA在組織中的表達具有廣譜性,在血細胞、鰓和斧足中高表達。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(lipopolysaccharides)感染三角帆蚌后,HcIRAK4轉錄水平在血細胞中的顯著上升表明其參與了機體對外界病原菌的免疫防御,同時也檢測到HcMyD88與HcIRAK4的表達模式相似,我們推測TLR信號通路參與了微生物入侵后機體早期的免疫應答。亞細胞定位實驗表明,HcIRAK4廣泛分布在細胞質中。在HEK293T細胞中過表達HcIRAK4重組質粒,雙熒光素酶報告基因實驗結果說明HcIRAK4蛋白對報告基因的轉錄活性無影響,但會顯著抑制由HcMyD88誘導激活的NF-?B和AP-1的轉錄活性,據(jù)此推斷在低等生物的TLR信號轉導途徑中可能存在著IRAK4負反饋調節(jié)機制。三角帆蚌TRAF6基因全長3986bp,編碼654個氨基酸序列,包含N端的RING、兩個鋅指結構域、一個C端卷曲螺旋的α結構域和一個保守的MATH結構域,這些功能結構域在進化過程中十分保守。熒光定量PCR顯示HcTRAF6的mRNA轉錄本在所有組織中組成型表達,積極響應嗜水氣單胞菌和脂多糖對機體的免疫刺激。雙熒光素酶報告基因實驗顯示HcTRAF6蛋白能以劑量依賴型顯著激活轉錄因子NF-κB。另外,借助RNA干擾技術有效敲減HcTRAF6后,再用致病菌嗜水氣單胞菌刺激機體,發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因的表達被抑制,同時機體對體內細菌的清除能力也下降了。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 2-1 注釋基因的 GO 功能分類Fig. 2-1 Gene ontology (GO) classification of the annotated unigenes

圖 2-1 注釋基因的 GO 功能分類Fig. 2-1 Gene ontology (GO) classification of the annotated unigenes

【參考文獻】

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本文編號：2729284