【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作為我國(guó)重要的淡水珍珠貝,具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在珍珠養(yǎng)殖過程中,插片移植是人工培育珍珠過程中的核心環(huán)節(jié)。供體貝的外套膜細(xì)胞小片插入受體貝中,刺激外套膜分泌珍珠質(zhì),一層薄薄的上皮細(xì)胞逐漸生成并包裹著小片形成珍珠囊,然而育珠貝在移植后一般會(huì)對(duì)外源的外套膜細(xì)胞小片產(chǎn)生免疫排斥,同時(shí)機(jī)體還受到外部環(huán)境中的病原細(xì)菌的危害,插片移植后的受體貝很有可能產(chǎn)生脫片,感染病菌發(fā)生炎癥反應(yīng)甚至導(dǎo)致死亡。因此,為了獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的珍珠,我們需要準(zhǔn)確掌握插片手術(shù)后育珠貝和外套膜細(xì)胞小片的生理免疫狀態(tài)的變化,全面了解珍珠囊發(fā)育時(shí)期的免疫因子調(diào)節(jié)機(jī)制,在珍珠囊形成的關(guān)鍵時(shí)期采取有效的護(hù)理措施,為推動(dòng)珍珠行業(yè)的高效可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)理論依據(jù)。本文利用二代測(cè)序技術(shù),對(duì)三角帆蚌進(jìn)行插片手術(shù)后,收集了0h,2h,6h,12h,24h,48h,96h,7d,14d和30d十個(gè)時(shí)期的珍珠囊樣品,構(gòu)建了三角帆蚌珍珠囊發(fā)育轉(zhuǎn)錄組文庫。組裝軟件拼接后,獲得了293863條平均長(zhǎng)度為588bp unigenes,最長(zhǎng)的為27255bp,N50讀長(zhǎng)為840bp,其中27176條unigenes在數(shù)據(jù)庫中得到了注釋。將unigenes映射到KEGG代謝途徑后,我們發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、NOD受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等15條涉及免疫功能的代謝通路在KEGG子類別中也被鑒定出來。緊接著,將珍珠囊10個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文本集兩兩對(duì)比,篩選鑒定得到4878條差異基因(DEGs)。依據(jù)DEGs的珍珠囊發(fā)育時(shí)空表達(dá)譜,構(gòu)建二維主元分析圖和聚類分析熱圖,分析后推測(cè)插片移植后細(xì)胞小片和育珠貝的生理狀態(tài)恢復(fù)正常需要一個(gè)月。同時(shí),我們將移植手術(shù)后育珠貝的生理狀態(tài)分為6個(gè)階段:0h,2h-6h,12h-24h,48h-7d,14d,30d,并重點(diǎn)研究0/2h,6 h/12 h,24 h/48 h,7 d/14 d和14 d/30d這五組差異基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制。通過對(duì)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)差異基因的Gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,發(fā)現(xiàn)各對(duì)比組的差異基因顯著富集在補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、MAPK信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路和幾丁質(zhì)代謝通路中,對(duì)此展開具體討論。此外,本文選取了8條免疫差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證,線性相關(guān)系數(shù)r值分布在0.86到0.97之間,表明熒光定量驗(yàn)證結(jié)果和測(cè)序結(jié)果具有高度一致性,進(jìn)而證明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性�；谝陨戏治鼋Y(jié)果,本文利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等手段,重點(diǎn)研究了Toll樣信號(hào)通路中的免疫差異基因Interleukin-1 receptor-associated kinase 4(IRAK4)和Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)。首先克隆了三角帆蚌IRAK4基因,該基因的cDNA全長(zhǎng)2595bp,開放閱讀框1674bp,編碼了557個(gè)氨基酸蛋白序列,預(yù)測(cè)的蛋白分子量為62.3 kDa,理論等電點(diǎn)為5.34。HcIRAK4蛋白高度保守,含有一個(gè)N端死亡結(jié)構(gòu)域(DD,5 115aa)、以及絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(STYKc,270 553aa)。熒光定量PCR顯示HcIRAK4的mRNA在組織中的表達(dá)具有廣譜性,在血細(xì)胞、鰓和斧足中高表達(dá)。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(lipopolysaccharides)感染三角帆蚌后,HcIRAK4轉(zhuǎn)錄水平在血細(xì)胞中的顯著上升表明其參與了機(jī)體對(duì)外界病原菌的免疫防御,同時(shí)也檢測(cè)到HcMyD88與HcIRAK4的表達(dá)模式相似,我們推測(cè)TLR信號(hào)通路參與了微生物入侵后機(jī)體早期的免疫應(yīng)答。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明,HcIRAK4廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)中。在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)HcIRAK4重組質(zhì)粒,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果說明HcIRAK4蛋白對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性無影響,但會(huì)顯著抑制由HcMyD88誘導(dǎo)激活的NF-?B和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性,據(jù)此推斷在低等生物的TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能存在著IRAK4負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。三角帆蚌TRAF6基因全長(zhǎng)3986bp,編碼654個(gè)氨基酸序列,包含N端的RING、兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域、一個(gè)C端卷曲螺旋的α結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的MATH結(jié)構(gòu)域,這些功能結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中十分保守。熒光定量PCR顯示HcTRAF6的mRNA轉(zhuǎn)錄本在所有組織中組成型表達(dá),積極響應(yīng)嗜水氣單胞菌和脂多糖對(duì)機(jī)體的免疫刺激。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示HcTRAF6蛋白能以劑量依賴型顯著激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。另外,借助RNA干擾技術(shù)有效敲減HcTRAF6后,再用致病菌嗜水氣單胞菌刺激機(jī)體,發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因的表達(dá)被抑制,同時(shí)機(jī)體對(duì)體內(nèi)細(xì)菌的清除能力也下降了。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 2-1 注釋基因的 GO 功能分類Fig. 2-1 Gene ontology (GO) classification of the annotated unigenes

圖 2-1 注釋基因的 GO 功能分類Fig. 2-1 Gene ontology (GO) classification of the annotated unigenes

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2729284