【摘要】：河川沙塘鱧(Odontobutis potamophila)主要分布于我國長江中下游地區(qū)。該魚為淡水底棲小型魚類,味道鮮美,具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,已成為一種具有發(fā)展?jié)摿Φ乃a(chǎn)養(yǎng)殖品種。河川沙塘鱧在生長過程中表現(xiàn)出顯著的性別二態(tài)性,雄性河川沙塘鱧比雌性同期生長速度快30%以上。因此,養(yǎng)殖雄性個(gè)體比雌性有著更大的經(jīng)濟(jì)效益。然而目前關(guān)于河川沙塘鱧在性別決定與分化機(jī)制方面的研究非常有限,這在一定程度上阻礙了河川沙塘鱧單性(全雄)育種研究。本文以河川沙塘鱧為研究對(duì)象,對(duì)其性別二態(tài)性的分子調(diào)控機(jī)制展開研究。首先基于高通量測序技術(shù)對(duì)其性腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與miRNA組聯(lián)合分析;接著從其性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選并克隆了與配子發(fā)生、性腺發(fā)育相關(guān)Piwils基因的cDNA全長,并對(duì)Piwils基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;最后,運(yùn)用熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡及免疫組化技術(shù),探究Piwils基因在河川沙塘鱧性腺發(fā)育及激素處理后的表達(dá)模式變化規(guī)律。主要研究結(jié)果如下:1.河川沙塘鱧性腺mRNA-seq和miRNA-seq聯(lián)合分析基于Illumina高通量測序?qū)哟ㄉ程流k精巢與卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與miRNA組聯(lián)合分析,包括精巢(OT a,OT b,OT c)與卵巢(OO a,OO b,OO c)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控后共獲得條287130130條clean reads。通過組裝,共獲得了 43494條 non-redundant genes 與 81051 條 transcripts。注釋到 Swiss-Prot、Nr、Pfam、KEGG、KOG、GO 數(shù)據(jù)庫的 All-unigene 分別為:19518、24291、19364、13895、18624、17358條。在精巢與卵巢中共發(fā)現(xiàn)了 16540個(gè)基因顯著差異表達(dá),其中8103個(gè)基因在精巢中顯著上調(diào),8437個(gè)基因在卵巢中顯著上調(diào)。另外分別在精巢與卵巢中獲得了 1130、1226個(gè)潛在SNP位點(diǎn)。miRNA組數(shù)據(jù)顯示,精巢與卵巢中分別獲得25512003與14111642條clean reads。共發(fā)現(xiàn)了 591個(gè)保守的miRNA并預(yù)測到了 85個(gè)新型miRNA,這些591個(gè)保守的miRNA屬于164個(gè)miRNA家族。精巢與卵巢中顯著差異的miRNA共有143個(gè),在精巢中顯著上調(diào)的miRNA有75個(gè),在卵巢中顯著上調(diào)的miRNA有68個(gè)�；陲@著差異的miRNA與mRNA進(jìn)行聯(lián)合分析,共發(fā)現(xiàn)超過50000對(duì)具有相互調(diào)控關(guān)系的miRNA-mRNApairs,其中 27583 對(duì) miRNA-mRNApairs 為負(fù)調(diào)控關(guān)系。挑選轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中43個(gè)與性別決定分化相關(guān)的基因與miRNA組中前16位顯著差異的miRNA進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,并構(gòu)建它們之間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。miRNA預(yù)測到關(guān)鍵靶基因的pairs包括miR-17a-Dmrt1、miR-17a-Foxl2等。2.河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因的克隆與表達(dá)分析采用RACE技術(shù),克隆了河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因的cDNA全長,Piwil1與Piwil2基因的全長分別為2934bp與3484bp。Piwil1與Piwil2基因分別包括2568bp的開放閱讀框(ORF),編碼856個(gè)氨基酸;3195bp的開放閱讀框(ORF)編碼1065個(gè)氨基酸;5'UTR區(qū)和3'UTR區(qū)分別為179bp和187bp、138bp和151bp;分子質(zhì)量分別為96.91kDa和118.71kDa;等電點(diǎn)分別為9.13和9.15。氨基酸序列分析結(jié)果表明河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因均具有保守的PAZ與PIWI結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果均表明,河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因在硬骨魚類的進(jìn)化過程中高度保守。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù),檢測了河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因在精巢、卵巢、肝、腦、鰓、心、腎、腸、肌肉、脾等10種組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,Piwil1與Piwil2在精巢、卵巢有極高的表達(dá)量。通過熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),檢測了河川沙塘鱧Piwil1與Piwil2基因在性腺Ⅰ-Ⅳ期發(fā)育過程中的表達(dá)模式,結(jié)果表明Piwil1與Piwil2的mRNA和蛋白表達(dá)量均在河川沙塘鱧精巢與卵巢發(fā)育的Ⅰ期達(dá)到峰值,并在隨后發(fā)育過程中呈顯著下降的趨勢。免疫組化結(jié)果顯示,Piwil1與Piwil2蛋白在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及早期卵母細(xì)胞中具有較高的表達(dá)量,而在成熟的精子及卵母細(xì)胞中不表達(dá)。通過向河川沙塘鱧體內(nèi)注射激素(HCG、LHRH-A2)后,性腺中Piwil1與Piwil2的mRNA與蛋白表達(dá)量均顯著下降。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

第２章河川沙塘鱧性腺ｍＲＮＡ－ｓｅｑ和ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑ聯(lián)合分析８ｐＬ，滅菌水邋７．４ｐＬ，２ｘＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘｌＯ｜ＬｉＬ。逡逑（４）邋ＰＣＲ擴(kuò)增條件為：９５°Ｃ預(yù)變性５邋ｍｉｎ；邋３０個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括３０邋ｓ，退火３０邋ｓ，７２°Ｃ延伸３０邋ｓ；邋７２°Ｃ延伸５ｍｉｎ，４°Ｃ保存。逡逑（５）測序分析：ＰＣＲ產(chǎn)物送至上海捷瑞生物有限公司進(jìn)行測序分析。逡逑實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑河川沙塘銷性腺ＨＥ染色逡逑實(shí)驗(yàn)所用河川沙塘鱧的精巢與卵巢均為ＩＶ期（圖２．１）。即精巢含有大量以及成熟的精子，卵巢中主要為成熟的卵母細(xì)胞。河川沙塘鱧的性腺分均參考中華烏塘鱷（５０Ｓ／７７Ｃ而0逡逑

為獲得河川沙塘鱧精巢與卵巢間顯著差異表達(dá)的基因，運(yùn)用ＲＰＫＭ方法對(duì)逡逑精巢（ＯＴａ，ＯＴｂ，ＯＴｃ）、卵巢（ＯＯａ，ＯＯｂ，ＯＯｃ）中所得到的ｃｏｕｎｔ數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。逡逑如圖２．３所示，精巢與卵巢比較，共獲得８１０３個(gè)顯著上調(diào)基因及８４３７個(gè)顯著下逡逑調(diào)基因（｜丨0§２『0丨（１（；１１３１１§６丨＞＝１，尸－￥３１１１６＜０．０５）。逡逑ｇ邐８１０３邐＾逡逑＿逡逑ＯＴｖｓＯＯ逡逑圖２．３河川沙塘鱧精巢與卵巢之間的差異基因逡逑注：紅色與綠色柱子分別表示在精巢與卵巢中顯著上調(diào)的基因。逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｔｅｓｔｉｓ邋ａｎｄ邋ｏｖａｒｙ邋ｉｎ邋ｇｏｎａｄ邋ｏｆ邋Ｏ．邋ｐｏｔａｍｏｐｈｉｌａ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｒｅｄ邋ａｎｄ邋ｇｒｅｅｎ邋ｂａｒ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｔｅｓｔｉｓ邋ａｎｄ邋ｏｖａｒｙ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑２３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 史東杰;孫硯勝;李文通;孟素宣;梁擁軍;張升利;張欣;朱莉飛;;魚類常用催產(chǎn)劑對(duì)錦鯉人工繁殖效果的影響[J];水產(chǎn)科技情報(bào);2015年03期

2 Hsueh-Yen Ku;Haifan Lin;;PIWI proteins and their interactors in piRNA biogenesis,germline development and gene expression[J];National Science Review;2014年02期

3 陳戟;胡煒;朱作言;;魚類生殖發(fā)育調(diào)控研究進(jìn)展[J];科學(xué)通報(bào);2013年02期

4 徐冬冬;尤鋒;樓寶;耿智;李軍;肖志忠;辛儉;;條石鯛雌雄魚核型及C-帶的比較分析[J];水生生物學(xué)報(bào);2012年03期

5 熊良偉;陶桂慶;王帥兵;孫繼真;李育培;;沙塘鱧室內(nèi)繁殖研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年06期

6 張曉彥;劉海金;;17β-雌二醇對(duì)半滑舌鰨性分化和生長的影響[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年06期

7 劉漢勤;崔書勤;侯昌春;徐江;陳宏溪;;從XY雌魚雌核發(fā)育產(chǎn)生YY超雄黃顙魚[J];水生生物學(xué)報(bào);2007年05期

8 任崗;章群;;中國沙塘鱧屬魚類線粒體12S rRNA基因序列分析[J];水生生物學(xué)報(bào);2007年04期

9 方永強(qiáng),張為民,翁幼竹,劉麗麗;17-β雌二醇誘導(dǎo)鯔雌性化的機(jī)制[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2004年02期

10 羅玉雙,夏維福,劉良國,韓慶,王文彬,李文健;黃顙魚人工繁殖及魚苗培育試驗(yàn)[J];水產(chǎn)科學(xué);2001年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周毅;多倍體鯽鯉Piwi和piRNA的表達(dá)與育性的相關(guān)性研究[D];湖南師范大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高長富;紅鰭東方渶amhrⅡ和amh基因的表達(dá)研究及性腺轉(zhuǎn)錄組的初步研究[D];大連海洋大學(xué);2016年

2 李春歌;高溫誘導(dǎo)對(duì)羅非魚性別分化相關(guān)基因表達(dá)的影響研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2728029