發(fā)布時(shí)間：2020-06-24 11:59

【摘要】：我國(guó)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)養(yǎng)殖業(yè)自2009年起出現(xiàn)急性肝胰腺壞死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND),使整個(gè)行業(yè)蒙受巨大的損失。研究表明,該病的爆發(fā)與凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)AHPND致病株副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,VP_(AHPND))含量超標(biāo)有關(guān)。本文先利用復(fù)方中草藥HD-4的主要成分—地榆(Sanguisorba officinalis L.)對(duì)VP_(AHPND)進(jìn)行了體外抑菌效果和機(jī)理的研究;通過(guò)小規(guī)模投喂試驗(yàn)探討了HD-4對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響;并通過(guò)生產(chǎn)試驗(yàn),檢驗(yàn)了攝食HD-4后凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)弧菌定量化控制的情況。本研究結(jié)論為復(fù)方中草藥HD-4在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用和AHPND防控技術(shù)的建立提供了理論支持。1、地榆對(duì)VP_(AHPND)生長(zhǎng)的影響為探究HD-4對(duì)VP_(AHPND)的抑制機(jī)理,我們選取HD-4的主要成分(地榆)為研究對(duì)象,進(jìn)行了不同提取方式的地榆藥液對(duì)VP_(AHPND)的抑制效果和不同濃度地榆醇提物對(duì)VP_(AHPND)生長(zhǎng)曲線影響的試驗(yàn)。結(jié)果顯示,地榆水提藥液(Ⅰ)、高溫處理后的地榆水提藥液(Ⅱ)、地榆醇提藥液(Ⅲ)和地榆醇提水沉藥液(Ⅳ)對(duì)VP_(AHPND)抑菌圈直徑分別為2.00cm、1.97cm、2.60cm和2.55cm。藥液(Ⅰ)和(Ⅱ)對(duì)VP_(AHPND)的最小抑菌濃度(MIC)為3.2mg/mL,最小殺菌濃度(MBC)為6.4mg/mL;而藥液(Ⅲ)和(Ⅳ)的MIC為1.6mg/mL,MBC也為6.4mg/mL。研究地榆醇提物對(duì)VP_(AHPND)生長(zhǎng)曲線影響時(shí),在藥物與細(xì)菌共同培養(yǎng)試驗(yàn)中,空白對(duì)照組、0.4mg/mL達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間分別為12h、18h;1.6mg/mL組未出現(xiàn)明顯的平臺(tái)期;6.4mg/mL組細(xì)菌未能正常生長(zhǎng)。在應(yīng)激培養(yǎng)試驗(yàn)中,各組在用藥之前(0-10h)生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)相同,用藥后(10-22h)0.4mg/mL組VP_(AHPND)生長(zhǎng)先被抑制后逐漸恢復(fù),20h達(dá)到最大值4.14×10~(10)CFU/mL;1.6mg/mL組VP_(AHPND)生長(zhǎng)受到顯著抑制,出現(xiàn)波動(dòng)。6.4mg/mL組在用藥后副溶血弧菌生長(zhǎng)受到顯著抑制,在20h時(shí)已無(wú)可培養(yǎng)的活菌。試驗(yàn)結(jié)果表明,地榆對(duì)VP_(AHPND)有顯著的抑制效果。2、地榆醇提物作用下VP_(AHPND)六種內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)為篩選適用于研究地榆對(duì)VP_(AHPND)抑制機(jī)理的內(nèi)參基因,本文利用qRT-PCR技術(shù)探究了地榆醇提物脅迫下副溶血弧菌6種常見內(nèi)參基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA、rpo S)的表達(dá)情況,利用GeNorm,Norm Finder,Best Keeper,Delta CT以及Ref Finder這5種方法對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估和篩選。相關(guān)結(jié)果表明:引物效率E(%)均在1.00±0.08以內(nèi),且在不同濃度地榆醇提物處理?xiàng)l件下,這六種內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性也較好。其中Ct值變化差異最小的為16S rRNA(CV=3.88),變化差異最顯著的為pvs A(CV=12.53)。5種方法對(duì)6種內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序略有差異,其中GeNorm給出的穩(wěn)定性排序?yàn)閞po S=16S rRNAgapdhrec Apvu Apvs A;Norm Finder結(jié)果為gapdhrpo Spvu A16Sr RNArec Apvs A;Best Keeper結(jié)果為16S rRNArpo Sgapdhrec Apvu Apvs A;Delta Ct結(jié)果為gapdhrpo Spvu A16S rRNArec Apvs A;Ref Finder綜合排名結(jié)果為rpo Sgapdh16S rRNApvu Apvs Arec A,本章根據(jù)配對(duì)變異系數(shù)結(jié)果,最終推薦同時(shí)使用rpo S和gapdh作為該條件下內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為從基因表達(dá)角度研究地榆對(duì)VP_(AHPND)作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)和理論支持,對(duì)建立以地榆為核心藥物的AHPND防控技術(shù)具有重要意義。3、地榆醇提物對(duì)VP_(AHPND)HPND T6SS表達(dá)的影響VP_(AHPND)是凡納濱對(duì)蝦AHPND的主要病原之一,其致病因子Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type VI secretion systems,T6SSs)與該病的發(fā)生密切相關(guān)。T6SS提供VP_(AHPND)粘附力、環(huán)境適應(yīng)力和種間競(jìng)爭(zhēng)力,在侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。抑制VP_(AHPND)HPND T6SS的表達(dá),能降低其對(duì)宿主的毒力,為AHPND的防控提供有效策略。本章利用qRT-PCR技術(shù)探究地榆醇提物對(duì)VP_(AHPND) T6SS中相關(guān)基因(VP1388、VP1393、VP1400、VP1409、VPA1027、VPA1043和VPA104)表達(dá)量的影響,以此探究地榆對(duì)VP_(AHPND)的作用機(jī)理。結(jié)果顯示,地榆醇提物能顯著抑制VPA1027、VPA1043和VPA1044的轉(zhuǎn)錄活性;高濃度的地榆醇提物對(duì)VP1388、VP1400和VP1409在短時(shí)間內(nèi)有激活作用,隨著時(shí)間推移,激活作用逐漸消失;對(duì)VP1393基因表達(dá)量影響較小。由此推測(cè)地榆醇提物可通過(guò)抑制副溶血弧菌生長(zhǎng)和T6SS功能,來(lái)削弱其對(duì)宿主的致病力,這為使用地榆防控對(duì)蝦AHPND的可行性提供了理論支持。4、口服HD-4對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響為了探究HD-4對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,我們對(duì)供試凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行小規(guī)模投喂試驗(yàn),并利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù),測(cè)定蝦苗腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,所有樣品中共檢測(cè)出650種不同的OTUs,其中有238種OTUs為五組樣品所有共有。試驗(yàn)前,供試蝦苗腸道內(nèi)主要細(xì)菌門包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)等。主要細(xì)菌目包括黃桿菌目(Flavobacteriales)、弧菌目(Vibrionales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、支原體目(Mycoplasmatales)等。主要細(xì)菌屬包括弧菌屬(Vibrio)和Spongiimonas等。試驗(yàn)結(jié)束后,各分類水平上細(xì)菌相對(duì)含量都出現(xiàn)了變化,其中,屬分類水平上,弧菌屬(Vibrio)和Spongiimonas變化最為顯著,其相對(duì)含量分別降至6.94%和0.54%。試驗(yàn)前后,ACE與Chao1指數(shù)顯著升高,表明對(duì)蝦腸道內(nèi)細(xì)菌豐度升高;而Simpson指數(shù)的降低和Shannon指數(shù)的升高,表明對(duì)蝦腸道菌群多樣性顯著升高。通過(guò)KEGG功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),E組比A組外源生物物質(zhì)代謝和能量物質(zhì)代謝能力顯著提升。本試驗(yàn)表明,HD-4能夠顯著改善凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝,該結(jié)果為HD-4的推廣與應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。5、口服HD-4對(duì)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)弧菌的定量化控制及防控示范為了探究鹵蟲和HD-4在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中對(duì)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)弧菌數(shù)量的影響,本章以固體TSB和TCBS平板培養(yǎng)基上菌落數(shù)作為衡量指標(biāo),在凡納濱對(duì)蝦標(biāo)粗、養(yǎng)成、親蝦培育以及患病治療四生理過(guò)程中進(jìn)行HD-4投喂試驗(yàn)。結(jié)果顯示,仔蝦標(biāo)粗試驗(yàn)中,試驗(yàn)前后給藥I組弧菌含量持續(xù)下降17.2倍;對(duì)照I組和給藥II組弧菌數(shù)量變化較為平穩(wěn);對(duì)照II組弧菌數(shù)量持續(xù)上升34.2倍。對(duì)蝦養(yǎng)成試驗(yàn)中,試驗(yàn)組弧菌數(shù)量隨著給藥節(jié)律出現(xiàn)顯著波動(dòng),最小值為0CFU/g(3d),最大值為1.89×10~4CFU/g(13d)。對(duì)照組對(duì)蝦體內(nèi)弧菌數(shù)量持續(xù)上升,最小值為1.62×10~2CFU/g,最大值為9.93×10~4 CFU/g。親蝦培育試驗(yàn)中,試驗(yàn)組弧菌數(shù)量呈波動(dòng)下降趨勢(shì),最小值5.30×10~3CFU/g(10d),較試驗(yàn)開始下降了12.3倍;對(duì)照組弧菌數(shù)呈波動(dòng)變化趨勢(shì),最小值為5.50×10~4CFU/g(0d),最大值為9.32×10~5CFU/g(7d)。AHPND治療試驗(yàn)中,試驗(yàn)組弧菌數(shù)量呈持續(xù)下降趨勢(shì),最小值8.22×10~6CFU/g(11d),較試驗(yàn)開始時(shí)下降了78.6倍;對(duì)照組弧菌數(shù)量呈波動(dòng)變化趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)弧菌數(shù)量為1.15×10~8CFU/g。渤海灣地區(qū)養(yǎng)殖鹵蟲體內(nèi)弧菌數(shù)量調(diào)研結(jié)果表明,雞糞肥水模式存在安全隱患。施用雞糞水樣中弧菌含量是未施用雞糞的122倍;施用雞糞池塘中的活鹵蟲體內(nèi)弧菌含量是未施用雞糞水池中活鹵蟲的42倍。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了HD-4在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用中的效果,為以HD-4為核心的對(duì)蝦AHPND防控技術(shù)的建立提供了數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S945.46
【圖文】：

1.1 我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖對(duì)蝦品種之一。其鹽度耐受范圍廣(0.5-50)[1]，最適鹽度為 30[2]。1988 年，凡納濱對(duì)蝦被引入我國(guó)進(jìn)行人工養(yǎng)殖，因其生長(zhǎng)塊、產(chǎn)量高、需求旺盛，迅速成為我國(guó)對(duì)蝦主要養(yǎng)殖品種之一。如今，已逐步形成引種、育種、養(yǎng)殖、加工和銷售為一體的完整產(chǎn)業(yè)鏈，是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中不可或缺的一員[3]。2017 年凡納濱對(duì)蝦海水養(yǎng)殖面積共 16.85 萬(wàn)公頃，占全國(guó)海水蝦類養(yǎng)殖面積的 66.79%；海水蝦類苗種共投放 12517.99 億尾，其中凡納濱對(duì)蝦蝦苗 9551.81 億尾，占比 76.30%；全年凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到108.08 萬(wàn)噸，占海水蝦類總產(chǎn)量的 80.34% (如圖 1)[4]。近年來(lái)，我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)進(jìn)入迅猛發(fā)展階段，新品種不斷涌現(xiàn)，養(yǎng)殖技術(shù)不斷跟新，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求旺盛。但是我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)還存在一些問(wèn)題。如種蝦資源受到跨國(guó)企業(yè)的制約，國(guó)產(chǎn)苗種質(zhì)量層次不齊；養(yǎng)殖病害多，發(fā)病急，防控難度大；部分蝦養(yǎng)殖廠尾水排放不達(dá)標(biāo)，面臨停業(yè)整頓；對(duì)蝦產(chǎn)量雖高但個(gè)頭小，品質(zhì)差，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力低等。(a)(b)

亞太地區(qū)對(duì)蝦養(yǎng)殖集中地相繼發(fā)生大面積死亡事件[5]，對(duì)整個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)均造成了重大損失[6, 7]。該病主要發(fā)生于放苗 30d 前后，在短時(shí)間內(nèi)造成蝦苗大量死亡[8]，被稱為早期死亡綜合征(Early mortality syndrome, EMS)[9]。該病于 2009年首次爆發(fā)于中國(guó)，隨后迅速傳播至越南(2010 年)，馬來(lái)西亞(2011 年)、泰國(guó)(2012年)、墨西哥(2013 年)、菲律賓(2015 年)、南美洲(2016 年)等地[6, 10-13]。該病主要特征為對(duì)蝦肝胰腺發(fā)白、萎縮、壞死，所以被命名為急性肝胰腺壞死綜合征(acutehepatopancreatic necrosis syndrome, AHPNS)，隨后更名為急性肝胰腺壞死病(acutehepatopancreatic necrosis disease, AHPND)并沿用至今[6]。目前發(fā)現(xiàn)該病主要感染中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[14]、凡納濱對(duì)蝦[15, 16]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[17]。發(fā)病早期，蝦苗肝胰腺發(fā)白并開始萎縮，而到了晚期，蝦苗肝胰腺表面黑色素沉積，出現(xiàn)黑色條紋或者斑點(diǎn)(圖 1-1)，組織病理學(xué)檢查可見對(duì)蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞脫落，并伴隨著血細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象(圖 1-2)[6]。研究表明該病可通過(guò)鹵蟲進(jìn)行傳播[18]。

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2 邵建春;凡納濱對(duì)蝦對(duì)飼料中魚粉替代物的響應(yīng)機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所);2019年

3 王興強(qiáng);凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus Vannamei）生長(zhǎng)和生物能量學(xué)的初步研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2004年

4 張志懷;高位蝦池水色及其它環(huán)境因子變化對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2005年

5 張留所;凡納濱對(duì)蝦分子標(biāo)記篩選、連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2006年

6 于赫男;環(huán)境脅迫對(duì)羅氏沼蝦和凡納濱對(duì)蝦行為、生長(zhǎng)及生理活動(dòng)的影響[D];暨南大學(xué);2007年

7 胡毅;凡納濱對(duì)蝦飼料配方優(yōu)化及幾種飼料添加劑的應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

8 張洋;扇貝、對(duì)蝦基因組BAC文庫(kù)構(gòu)建及其重要功能基因的初步篩選和分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2008年

9 李二超;鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生理影響及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)[D];華東師范大學(xué);2008年

10 史英力;以凡納濱對(duì)蝦β-actin基因啟動(dòng)子為元件的重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 吳丹;不同生長(zhǎng)階段凡納濱對(duì)蝦與羅氏沼蝦營(yíng)養(yǎng)成分的研究[D];上海海洋大學(xué);2019年

2 羅強(qiáng);凡納濱對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)中浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)及功能研究[D];上海海洋大學(xué);2019年

3 張龍;凡納濱對(duì)蝦中間培育密度及循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)研究[D];上海海洋大學(xué);2019年

4 楊澤禹;口服復(fù)方中草藥（HD-4）定量化控制對(duì)蝦體內(nèi)有害菌數(shù)量的研究[D];上海海洋大學(xué);2019年

5 甄曉然;凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥弧菌江蘇株的分子分型及其拮抗菌篩選[D];上海海洋大學(xué);2019年

6 賈高旺;脂肪酸鈣替代魚油和豆油對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

7 杜殷煒;玉屏風(fēng)多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及免疫機(jī)能的影響[D];佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院;2017年

8 朱昔恩;國(guó)審品種凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）“桂海1號(hào)”生態(tài)育苗技術(shù)研究[D];西華師范大學(xué);2019年

9 段偉文;應(yīng)用低壓靜電場(chǎng)與氣調(diào)包裝進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦保鮮的研究[D];廣東海洋大學(xué);2019年

10 孫衛(wèi)芳;養(yǎng)殖對(duì)蝦五種常見病原的MNPCR檢測(cè)法的構(gòu)建優(yōu)化[D];浙江海洋大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2727835