【摘要】：銅是包括魚在內(nèi)所有動(dòng)物的必需營養(yǎng)元素,銅以輔酶的形式在體內(nèi)發(fā)揮生理作用,機(jī)體氧化還原反應(yīng)、鐵離子代謝、能量生成、膠原合成和腦神經(jīng)遞質(zhì)生成等一系列生理生化過程都和銅有關(guān)。飼料銅是魚類銅的主要來源,過量的銅會(huì)對魚類造成氧化損傷和毒性作用。魚體內(nèi)銅含量的高低受到吸收和排出兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響,其中銅在魚消化道內(nèi)的吸收、利用過程過程尤為重要。影響魚類飼料銅吸收的因素很多,銅的化學(xué)形式是其中最主要的一個(gè)因素。俄羅斯鱘Acipenser gueldenstaedtii是世界范圍內(nèi)廣泛養(yǎng)殖的一種經(jīng)濟(jì)魚類。迄今為止,俄羅斯鱘銅營養(yǎng)生理研究還比較滯后。為探究銅對俄羅斯鱘的基本生理作用,查明俄羅斯鱘飼料銅的需要量以及俄羅斯鱘對飼料銅的生物利用率,本文主要進(jìn)行以下四方面的研究:1)飼料銅對俄羅斯鱘幼魚生長、體組生化和抗氧化能力的影響;2)俄羅斯鱘對飼料銅水平響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析;3)俄羅斯鱘幼魚對不同銅源的生物利用率比較研究;4)俄羅斯鱘銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白克隆、組織分布及表達(dá)分析。取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.飼料銅對俄羅斯鱘幼魚生長、體組生化和抗氧化能力的影響為探討銅對俄羅斯鱘生長、體組生化和抗氧化能力的影響并估測俄羅斯鱘飼料銅的需要量,以硫酸銅(CuSO4·5H2O)為銅源向半純合料中添加0、1、2、4、6、8和16mg/kg的飼料銅(實(shí)測值分別為0.3、1.5、2.4、4.4、6.2、8.3和16.1mg/kg)配制7種試驗(yàn)飼料。每種試驗(yàn)飼料分別投喂3缸俄羅斯鱘幼魚(重量11.84 ± 0.07 g)8周,養(yǎng)殖期間水體銅含量0.8-1.2 μg/L。結(jié)果顯示:飼料銅含量2.4-8.3 mg/kg組俄羅斯鱘增重率和飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于0.3、1.5和16.1 mg/kg組,其中6.2 mg/kg組俄羅斯鱘增重率最高。飼料銅含量6.2-16.1 mg/kg組俄羅斯鱘全魚和肝臟銅含量顯著高于其他各組。飼料銅含量6.2和8.3 mg/kg組俄羅斯鱘肝臟銅鋅超氧化物歧化酶活力、肝臟總抗氧化能力和血清銅藍(lán)蛋白活力顯著高于其他各組,肝臟丙二醛含量顯著低于其他各組。各組魚存活率、肝臟指數(shù)、內(nèi)臟指數(shù)、肥滿度、全魚粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分無顯著差異。以增重率、全魚銅含量、肝臟銅鋅超氧化物歧化酶和血清銅藍(lán)蛋白活力為評價(jià)指標(biāo)計(jì)算得到俄羅斯鱘幼魚飼料銅需要量為7-8 mg/kg。結(jié)果表明水體中銅不能滿足俄羅斯鱘的生長,生產(chǎn)中必須在飼料中額外補(bǔ)充銅,但過量添加銅也會(huì)導(dǎo)致俄羅斯鱘生長性能和抗氧化能力下降,建議生產(chǎn)中俄羅斯鱘幼魚飼料銅控制在7-8 mg/kg。2.俄羅斯鱘對飼料銅水平響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為更好地揭示銅的生理作用,需要進(jìn)一步了解銅對俄羅斯鱘基因表達(dá)的影響,為此選擇了飼料銅含量為0、6和16 mg/kg(簡記為銅缺乏組、銅適宜組和銅過量組)組俄羅斯鱘肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。Illumina測序結(jié)果顯示,除去低質(zhì)量片段后共拼接出72270條基因(unigene),平均長度1053 bp,N50長度1328 bp。與銅適宜組鱘相比,銅缺乏組共有1750個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào),463個(gè)基因發(fā)生顯著性下調(diào)。銅過量組發(fā)生顯著性上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)目分別為3228和1938。GO分析表明,銅缺乏組有187個(gè)生物過程(BP),34個(gè)細(xì)胞組分(CC)和118個(gè)分子功能(MF)發(fā)生顯著變化,對應(yīng)的注釋數(shù)目在銅過量組分別為225、29和140。KEGG分析表明銅缺乏組有30條通路發(fā)生顯著性變化,銅過量組有38條通路發(fā)生顯著性變化。上述發(fā)生顯著性變化的功能和通路主要與能量物質(zhì)(糖類和脂類)代謝、免疫功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果提示銅主要通過能量和免疫相關(guān)途徑來影響俄羅斯鱘的生長和生理功能,今后魚類銅營養(yǎng)生理研究可聚焦在能量代謝和免疫相關(guān)通路。3.俄羅斯鱘幼魚對不同銅源的生物利用率比較研究為研究俄羅斯鱘對飼料中硫酸銅(CuS04)、蛋氨酸銅(CuMet)和納米氧化銅(CuONano)三種形式銅的利用率。向半純合基礎(chǔ)飼料(對照組)中添加2、4、6、8 和 16 mg/kg 銅的 CuMet 或 CuONano,4、6 和 16 mg/kg 銅的 CuSO4。每種飼料投喂3缸俄羅斯鱘(重量9.82 ± 0.08 g)8周,養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila攻毒和銅表觀消化率測定。結(jié)果表明:與CuSO4相比,達(dá)到相同增重率、組織銅含量、抗氧化和免疫能力需要的CuMet和CuONano形式銅更少。CuMet和CuONano組魚銅表觀消化率高于CuSO4組,抗A.hydrophila感染能力也更強(qiáng)。CuSO4、CuMet和CuONano三種銅源最大增重率(WGR)、全魚銅含量、銅表觀消化率、銅鋅超氧化物歧化酶活力(Cu-Zn SOD)、總抗氧化能力、溶菌酶、免疫球蛋白M含量分別在6、4和4mg/kg飼料銅組獲得,最大值之間無顯著差異。以WGR、Cu-Zn SOD活力、全魚銅含量為評價(jià)指標(biāo),CuMet和CuONano的生物學(xué)效價(jià)約為CuSO4的1.5-2.0倍,根據(jù)銅源種類的差異俄羅斯鱘幼魚飼料銅的適宜需要量為5-8 mg/kg。綜上,CuMet和CuONano比CuSO4生物學(xué)效價(jià)更高,可以有效地被機(jī)體利用而減少俄羅斯鱘飼料中銅的添加量。這對控制養(yǎng)殖生產(chǎn)中飼料銅的排出、減少水環(huán)境污染有重要的借鑒作用。但CuMet和CuONano和CuSO4相比沒有額外促生長效應(yīng),吸收效率的提高是導(dǎo)致生物效價(jià)升高的主要原因。4.俄羅斯鱘銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白克隆、組織分布及表達(dá)分析為了解俄羅斯鱘對飼料中不同銅源吸收差異的原因,分別選擇銅源生物利用率試驗(yàn)中銅水平為4、6和16 mg/kg組鱘樣品從分子水平進(jìn)行以下三方面研究:1)俄羅斯鱘銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr1 cDNA全長克隆;2)俄羅斯鱘Ctr1、ATP7A和ATP7B在組織中mRNA表達(dá);3)不同飼料銅源對俄羅斯鱘Ctr1、ATP7A、ATP7B、CCS和SOD基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果:1)Ctr1在鰓、心臟、肝臟和前腸高表達(dá),ATP7A在前腸、肝臟、脾臟和鰓,ATP7B在肝臟和鰓中表達(dá)量較高;2)克隆得到編碼202個(gè)氨基酸的俄羅斯鱘銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr1。該蛋白有三個(gè)跨膜區(qū),N端和C端存在富含蛋氨酸的銅結(jié)合位點(diǎn)。3)鱘飼料中分別添加4和6 mg/kg飼料銅時(shí),CuMet 和 CuNano 組鱘 Ctr1、ATP7A 和 ATP7B mRNA 表達(dá)量高于 CuSO4組,對應(yīng)的Ctr1蛋白表達(dá)量在CuMet和CuNano組也較高。當(dāng)飼料銅含量為16 mg/kg時(shí),Ctr1蛋白表達(dá)量降低。Cu-Zn SOD和CCS熒光定量結(jié)果顯示可能不存在轉(zhuǎn)錄水平的Cu-Zn SOD表達(dá)調(diào)控。以上結(jié)果顯示,俄羅斯鱘飼料銅的主要吸收部位在前腸,肝臟是其銅代謝的中心器官。飼料中氨基酸螯合形式銅或納米形式銅比硫酸銅更能夠在RNA和蛋白水平上調(diào)銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá),從而有效提高了銅的消化吸收和保留率。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S965.215
【圖文】：

在內(nèi)的高等動(dòng)物，其體內(nèi)的銅含量受到吸收、分配、存儲和排泄等多個(gè)控（Ｇｒｏｓｅｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９８ｂ；邋Ｋａｍｕｎｄｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００１）。動(dòng)物體內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的主圖邋１－１邋所示（Ｍｅｒｃｅｒ邋ａｎｄ邋Ｌｌａｎｏｓ，邋２００３）。逡逑

２．２魚類銅的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制逡逑銅的吸收、排泄和利用依賴于參與銅代謝的各組織在細(xì)胞水平上的銅轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)逡逑制。細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也是維持細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)（圖１－２）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１），逡逑細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)主要包括兩方面內(nèi)容：１）細(xì)胞膜上銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞外的銅轉(zhuǎn)入細(xì)逡逑胞或者將細(xì)胞內(nèi)的銅轉(zhuǎn)出細(xì)胞；２）細(xì)胞內(nèi)的銅伴侶蛋白將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的銅轉(zhuǎn)運(yùn)逡逑到相應(yīng)的靶蛋白或者細(xì)胞器。銅進(jìn)出細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)銅的再分配都需要依賴特異逡逑性的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和銅伴侶蛋白，這些蛋白質(zhì)主要有細(xì)胞膜上的銅特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白逡逑家族（Ｃｏｐｐｅｒ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｔｒ）家族，Ｃｕ－Ｐ邋型邋ＡＴＰ邋酶（ＡＴＰ７Ａ邋和邋ＡＴＰ７Ｂ）逡逑和二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（ｄｉｖａｌｅｎｔ邋ｍｅｔａｌ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤＭＴ１）以及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)逡逑胞色素ｃ氧化酶銅伴侶蛋白（ＣＯＸ１７）、ＣＣＳ、ＡＴＯＸ１和金屬硫蛋白ＭＴ。銅從逡逑１０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2726363