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蛙類養(yǎng)殖中常見氣單胞菌屬致病菌的檢測技術(shù)開發(fā)

發(fā)布時間:2020-06-17 10:26
【摘要】:蛙類養(yǎng)殖業(yè)可以滿足人類食用、藥用等需求,但是,一些疾病的爆發(fā)常使得蛙類養(yǎng)殖戶遭受巨大的損失。當(dāng)蛙類在養(yǎng)殖過程中爆發(fā)疾病的時候,常見多為細菌性疾病,傳統(tǒng)的研究方法一般是,首先調(diào)查病原體,從病蛙的體內(nèi)分離并純化得到細菌,然后通過一系列生理生化和分子手段去鑒定細菌,接著通過回歸感染實驗驗證病原菌,最后通過藥敏試驗,提出治療藥物的選擇建議。這一過程,往往周期比較長,并且此時許多蛙患病程度已經(jīng)很嚴(yán)重。本研究從致病菌的角度入手,以最常見的氣單胞菌屬(Aeromonas)蛙類致病菌(嗜水氣單孢菌(A.hydrophila)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、維氏氣單胞菌(A.veronii))作為研究重點,利用環(huán)境DNA技術(shù)和多重PCR,建立蛙類養(yǎng)殖中常見氣單胞菌屬致病菌的檢測技術(shù),并試圖從屬的水平上提供用藥參考,以期為蛙類細菌性疾病早期防治工作提供新思路及理論基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下:1、建立了一種提取水體環(huán)境DNA的方法。采用濾膜法和沉淀法對兩個不同大小的水域進行環(huán)境DNA提取,并比較了所得環(huán)境DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量,以此建立了一種高效實用的水環(huán)境DNA提取方法,可以適用于條件不同的水體。2、通過比較4種氣單胞菌屬常見致病菌及其他14個非氣單胞菌的蛙類致病菌屬16S rDNA序列,篩選出了2對可以用于氣單胞菌屬蛙類常見致病菌PCR擴增的特異性引物,PCR擴增產(chǎn)物大小分別為229bp和688bp,并且還可以結(jié)合環(huán)境DNA技術(shù)對水體進行氣單孢菌屬蛙類常見致病菌檢測。3、通過比較嗜水氣單孢菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和維氏氣單胞菌這4種氣單胞菌屬常見致病菌gyrB基因序列,設(shè)計篩選出4對可以用于鑒定這4種氣單胞菌的特異性引物,其中,用于鑒定嗜水氣單孢菌的引物PCR擴增產(chǎn)物大小為266bp;用于鑒定溫和氣單胞菌的引物PCR擴增產(chǎn)物大小為99bp;用于鑒定豚鼠氣單胞菌的引物PCR擴增產(chǎn)物大小為518bp;用于鑒定維氏氣單胞菌的引物PCR產(chǎn)物大小為120bp。并利用多重PCR技術(shù),建立了嗜水氣單孢菌/維氏氣單胞菌的雙重PCR以及溫和氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌的雙重PCR,可以用于這四種氣單胞菌快速檢測。4、根據(jù)文獻篩選出的10種抗菌藥物,由此對嗜水氣單孢菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和維氏氣單胞菌這4種氣單胞菌屬常見致病菌進行藥敏試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這10種抗菌藥物的對氣單胞菌屬蛙類常見致病菌的抑菌效果都很好。
【學(xué)位授予單位】:浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號】:S943
【圖文】:

水樣處理,樣本量,瓊脂糖凝膠電泳,自上而下


圖 2.1 不同水樣處理方法和不同樣本量下各組 eDNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖.1 The results of eDNA from different handle methods of water samples and different samrker DL2000,DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)自上而下為 2000 bp,1000 bp,750 bp,500 bp,250 bp,1

細菌


21圖 2.2 各組 eDNA 經(jīng)細菌 16S rDNA PCR 擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig. 2.2 The results of eDNA which amplified by bacterial 16S rDNA

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